第五章 细胞工程及其在食品工业中的应用第一节 细胞工程的基本概念与技术第二节 动物细胞工程及其在食品工业中的应用第三节 植物细胞工程及其在食品工业中的应用第四节 微生物细胞工程及其在食品工业中的应用(略)本章主要内容一、细胞工程 （Cell engineering）定义是指以细胞为基本单位，在体外条件下进行培养、繁殖，或人为地使细胞某些 生物学特性按人们的意愿发生改变，从而 达到改良生物品种和创造新品种，加速繁 育动、 植物个体，以获得某种有用的物质 的过程。第一节 细胞工程的基本概念与技术所涉及的主要技术有： 细胞与组织培养技术 细胞融合技术 细胞拆分技术 染色体工程 胚胎工程 等等 二、细胞工程的基本技术1、细胞培养技术细胞培养技术：是指使动物、植物在体外无菌 、适温和丰富的营养条件下分裂、生长的一门 技术。一般是将有机体内的某一组织取出，经处理使其分散成单个细胞，并接种到培养基中进 行培养，使细胞生长、分裂。植物细胞培养2、细胞融合技术细胞融合技术（cell fusion technology）：是指通过人工方法使遗传性状不同的原生质体（除去细胞壁的细胞）相互接触后发生融合，导致染色体等遗传物质重组并形成新物种或新品种的技术，又称体细胞杂交。细胞融合的优点: 克服种属间杂交的“不育性”，可进行远缘杂交 基因重组频率高，重组类型多。 可将由其他育种方法获得的优良性状，经原生质体融合而组合到一个细胞中 可以是两个以上亲株同时参与融合，可形成多种性状的融合子生物学法：仙台病毒（HVJ）法。化学融合剂法：聚乙二醇（PEG）法。电处理融合法：利用细胞融合仪。促进细胞融合的方法:细胞融合的基本过程:主要过程包括三方面: 1、制备原生质体原生质体：指那些已去除细胞壁的细胞，细胞 外仅由细胞膜包裹，呈圆形，要在高渗液中才 能维持细胞的相对稳定。 2、诱导细胞融合 3、筛选融合子（来自两亲代的遗传物质经过交换并发生重组而形成的融合重组子）Zimmermann教授的燕麦原生质体的融合图像 第二节 动物细胞工程及其应用 一、动物细胞培养是将动物细胞或组织从机体取出，分散成单个细胞，并给予必要的生长条件，模拟体内生长 环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使细 胞在体外继续生长和增殖的过程。在整个过程中 细胞不出现分化，不再形成组织。动物细胞工程概述动物细胞工程概述bb动物细胞工程动物细胞工程动物细胞培养动物细胞培养动物细胞融合动物细胞融合单克隆抗体制备应用单克隆抗体制备应用胚胎移植胚胎移植核核 移移 植植动物细胞培养基本概念动物细胞培养基本概念bb培养液的成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐培养液的成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐 、维生素和动物血清等、维生素和动物血清等bb原代培养：单个细胞传至十代左右原代培养：单个细胞传至十代左右bb传代培养：经原代培养的细胞可传传代培养：经原代培养的细胞可传4040到到5050 代。代。bb细胞株：细胞株：1010到到4040、5050代的细胞，遗传物代的细胞，遗传物 质没发生改变。质没发生改变。bb细胞系：超过细胞系：超过5050代的细胞，遗传物质发生代的细胞，遗传物质发生 改变，可无限增殖。改变，可无限增殖。二、动物细胞培养基 天然培养基：直接采用动物体液或从动物组织中 提取成分作为培养液，主要有血清、组织提取液 、鸡胚汁等。合成培养基：主要是氨基酸、维生素、碳水化合 物、无机盐等，一般都加入一定量的血清。无血清细胞培养基:成分有基础培养基和替代血清的补充因子（胰岛素、转铁蛋白、生长因子和 激素等）。动物细胞培养过程动物细胞培养过程胚胎成幼龄动物的组织器官（细胞来源）胚胎成幼龄动物的组织器官（细胞来源）单个细胞单个细胞原代细胞原代细胞细胞株细胞株细胞系细胞系剪碎胰蛋白酶剪碎胰蛋白酶分离细胞分离细胞洗涤、稀释、分离洗涤、稀释、分离原代培养原代培养传代培养传代培养（遗传物质没有发生改变）（遗传物质没有发生改变）（遗传物质发生改变）（遗传物质发生改变）动物细胞培养应用动物细胞培养应用1.1.生产有价值的蛋白质制品，（如病生产有价值的蛋白质制品，（如病 毒疫苗、干扰素、单克隆抗体、动物激毒疫苗、干扰素、单克隆抗体、动物激 素）素）2.2.检测有毒物质检测有毒物质3.3.用于某些器官移植用于某些器官移植动物细胞融合动物细胞融合仙台病毒仙台病毒丧失感染活性（ 不感染细胞）保留融合活性（ 诱导细胞融合）紫外线物理法化学法生物法融合过程示意图单克隆抗体的概念单克隆抗体的概念bb单单: : 单个细胞单个细胞bb克隆克隆: : 无性繁殖无性繁殖bb抗体抗体: : 化学性质单一、特异性强化学性质单一、特异性强bb实验目的实验目的: :制备单克隆抗体制备单克隆抗体. .bb实验原理：实验原理：B B淋巴细胞能产生抗体，骨髓淋巴细胞能产生抗体，骨髓 瘤细胞能无限增殖，杂交瘤细胞既能产瘤细胞能无限增殖，杂交瘤细胞既能产 生抗体又能无限增殖。生抗体又能无限增殖。bb实验材料：小白鼠实验材料：小白鼠bb实验器材：培养皿、针筒等等。实验器材：培养皿、针筒等等。bb实验过程：如下页实验过程：如下页根据阿根廷科学家米尔斯坦和德国科学家柯根据阿根廷科学家米尔斯坦和德国科学家柯 勒设计的。其实验方案勒设计的。其实验方案: :单克隆抗体制备过程简简简简要介要介绍单绍单绍单绍单 克隆抗体的制克隆抗体的制备过备过备过备过 程程bb1 1、免疫、免疫动动物物 免疫免疫动动物是用目的抗原免疫小鼠，使物是用目的抗原免疫小鼠，使 小鼠小鼠产产生致敏生致敏B B淋巴淋巴细细胞的胞的 过过程。程。 一般一般选选 用用6-86-8周周龄龄雌性雌性Balb/cBalb/c小鼠，按照小鼠，按照预预先制定先制定 的免疫方案的免疫方案进进行免疫注射。行免疫注射。 抗原通抗原通过过血液血液 循循环环或淋巴循或淋巴循环进环进 入外周免疫器官，刺激入外周免疫器官，刺激 相相应应B B淋巴淋巴细细胞克隆，使其活化、增殖，并胞克隆，使其活化、增殖，并 分化成分化成为为致敏致敏B B淋巴淋巴细细胞。胞。bb2 2、细细胞融合胞融合 采用眼球摘除放血法采用眼球摘除放血法处处死小死小 鼠，无菌操作取出脾鼠，无菌操作取出脾脏脏，在平皿内，在平皿内挤压挤压 研研 磨，制磨，制备备脾脾细细胞胞悬悬液。液。 将准将准备备好的同系骨好的同系骨 髓瘤髓瘤细细胞与小鼠脾胞与小鼠脾细细胞按一定比例混合，胞按一定比例混合， 并加入促融合并加入促融合剂剂聚乙二醇。在聚乙二醇作聚乙二醇。在聚乙二醇作 用下，各种淋巴用下，各种淋巴细细胞可与骨髓瘤胞可与骨髓瘤细细胞胞发发生生 融合，形成融合，形成杂杂交瘤交瘤细细胞。胞。简简简简要介要介绍单绍单绍单绍单 克隆抗体的制克隆抗体的制备过备过备过备过 程程bb3 3、选择选择 性培养性培养 选择选择 性培养的目的是性培养的目的是筛选筛选 融合融合 的的杂杂交瘤交瘤细细胞，一般采用胞，一般采用HATHAT选择选择 性培养基。性培养基。 在在HATHAT培养基中，未融合的骨髓瘤培养基中，未融合的骨髓瘤细细胞因缺乏次胞因缺乏次 黄黄嘌嘌呤呤- -鸟鸟嘌嘌呤呤- -磷酸核糖磷酸核糖转转移移酶酶，不能利用，不能利用补补救救 途径合成途径合成DNADNA而死亡。而死亡。 未融合的淋巴未融合的淋巴细细胞胞虽虽具具 有次黄有次黄嘌嘌呤呤- -鸟鸟嘌嘌呤呤- -磷酸核糖磷酸核糖转转移移酶酶，但其本身，但其本身 不能在体外不能在体外长长期存活也逐期存活也逐渐渐死亡。死亡。 只有融合的只有融合的 杂杂交瘤交瘤细细胞由于从脾胞由于从脾细细胞胞获获得了次黄得了次黄嘌嘌呤呤鸟鸟嘌嘌 呤磷酸核糖呤磷酸核糖转转移移酶酶，并具有骨髓瘤，并具有骨髓瘤细细胞能无限增胞能无限增 殖的特性，因此能在殖的特性，因此能在HATHAT培养基中存活和增殖。培养基中存活和增殖。简简简简要介要介绍单绍单绍单绍单 克隆抗体的制克隆抗体的制备过备过备过备过 程程bb4 4、杂杂交瘤阳性克隆的交瘤阳性克隆的筛选筛选 与克隆化与克隆化 在在HATHAT培养培养 基中生基中生长长的的杂杂交瘤交瘤细细胞，只有少数是分泌胞，只有少数是分泌预预定特定特 异性异性单单克隆抗体的克隆抗体的细细胞，因此，必胞，因此，必须进须进 行行筛选筛选 和和 克隆化。通常采用有限稀克隆化。通常采用有限稀释释法法进进行行杂杂交瘤交瘤细细胞的胞的 克隆化培养。采用灵敏、快速、特异的免疫学方克隆化培养。采用灵敏、快速、特异的免疫学方 法，法，筛选筛选 出能出能产产生所需生所需单单克隆抗体的阳性克隆抗体的阳性杂杂交瘤交瘤 细细胞，并胞，并进进行克隆行克隆扩扩增。增。经过经过 全面全面鉴鉴定其所分泌定其所分泌 单单克隆抗体的免疫球蛋白克隆抗体的免疫球蛋白类类型、型、亚类亚类 、特异性、特异性、 亲亲和力、和力、识别识别 抗原的表位及其分子量后，及抗原的表位及其分子量后，及时进时进 行行冻冻存。存。简简简简要介要介绍单绍单绍单绍单 克隆抗体的制克隆抗体的制备过备过备过备过 程程bb5 5、单单克隆抗体的大量制克隆抗体的大量制备备 单单克隆抗体的大量克隆抗体的大量 制制备备重要采用重要采用动动物体内物体内诱诱生法和体外培养法生法和体外培养法 。 (1)(1)体内体内诱诱生法生法 取取Balb/cBalb/c小鼠，首先腹腔注射小鼠，首先腹腔注射 0.5ml0.5ml液体石腊或降植液体石腊或降植烷进烷进 行行预处预处 理。理。1-21-2周周 后，腹腔内接种后，腹腔内接种杂杂交瘤交瘤细细胞。胞。杂杂交瘤交瘤细细胞在胞在 小鼠腹腔内增殖，并小鼠腹腔内增殖，并产产生和分泌生和分泌单单克隆抗体。克隆抗体。 约约1-21-2周，可周，可见见小鼠腹部膨大。用注射器抽取小鼠腹部膨大。用注射器抽取 腹水，即可腹水，即可获获得大量得大量单单克隆抗体。克隆抗体。简简简简要介要介绍单绍单绍单绍单 克隆抗体的制克隆抗体的制备过备过备过备过 程程bb(2)(2)体外培养法体外培养法 将将杂杂交瘤交瘤细细胞置于培养瓶中胞置于培养瓶中 进进行培养。在培养行培养。在培养过过程中，程中，杂杂交瘤交瘤细细胞胞产产 生并分泌生并分泌单单克隆抗体，收集培养上清液，克隆抗体，收集培养上清液， 离心去除离心去除细细胞及其碎片，即可胞及其碎片，即可获获得所需要得所需要 的的单单克隆抗体。但克隆抗体。但这这种方法种方法产产生的抗体量生的抗体量 有限。近年来，各种新型培养技有限。近年来，各种新型培养技术术和装置和装置 不断出不断出现现，大大提高了抗体的生，大大提高了抗体的生产产量。量。简简简简要介要介绍单绍单绍单绍单 克隆抗体的制克隆抗体的制备过备过备过备过 程程简简简简要介要介绍单绍单绍单绍单 克隆抗体的制克隆抗体的制备过备过备过备过 程程bb杂杂交瘤交瘤细细胞融合后，要胞融合后，要进进行行筛选筛选 后才能使后才能使 用。用。杂杂交瘤交瘤细细胞分胞分为为两次：两次：bb一、一、筛选筛选 出出杂杂交瘤交瘤细细胞胞; ;bb二、在初二、在初选选的的杂杂交瘤交瘤细细胞中胞中筛选筛选 出能出能产产生生 特异性抗体的特异性抗体的杂杂家瘤家瘤细细胞，胞，这这两次两次筛选筛选 的的 方法和原理各不相同。方法和原理各不相同。bb大大规规模生模生 产单产单 克隆克隆 抗体流程抗体流程单克隆抗体的应用单克隆抗体的应用bb主要用于疾病的诊断、治疗和预防。与常规主要用于疾病的诊断、治疗和预防。与常规 抗体相比，具有特异性强、灵敏度高的优点抗体相比，具有特异性强、灵敏度高的优点 。如；各种癌症、肝炎病毒、。如；各种癌症、肝炎病毒、SARSSARS病毒、细病毒、细 菌及血吸虫等数百种疾病的诊断；在疾病治菌及血吸虫等数百种疾病的诊断；在疾病治 疗方面，单克隆抗体犹如人体卫士，能识别疗方面，单克隆抗体犹如人体卫士，能识别“ “ 自己自己” ”与与“ “