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狂犬病实验室检测技术1 一、实验室操作前的要求及准备 二、实验室检测方法2实验室操作前的要求及准备(一)实验室条件及生物安全操作要求(二)检测标本的要求(三)实验前准备3(一)实验室条件及生物安全操作要求1、暴露前免疫工作人员需要暴露前免疫意外暴露于狂犬病毒时,必需立即报告部门负责人。2、P2实验室操作所有潜在狂犬病感染的材料均应在P2 或P3实验室内进行(实验室固定毒在P2,病人或动物分离的街毒在P3)。3、P3实验室对动物标本进行狂犬病毒分离时,必须在P3 以上条件的专业实验 室中进行。 没有P3 实验室,严禁从事狂犬病毒分离工作。44、个人防护实验前要穿戴好防护服、眼镜、手套,作好技术上的准备。5、防止气溶胶扩散由于空气传播狂犬病毒已经得到证实,因此高速混悬或离心操作 应在密闭状态下进行。6、实验后消毒处理实验后要作好善后消毒处理, 狂犬病毒对脂溶剂(肥皂水、醚、氯 仿、丙酮),4570%乙醇,碘制剂和四铵化合物敏感,操作完毕对 操作台、实验材料等要用相应的消毒剂或高压蒸汽进行消毒处理。51、采集时间 (1)应尽量采集较新鲜的标本。(2)采集时无菌操作,避免标本污染 2、标本保存(1)尽量低温保存(2)存放于无菌离心管中并进行编号。 3、标本类型(1)唾液、脑脊液、眼角膜、咬伤处皮肤组织、脑组织、血清等。(2)唾液、脑脊液、眼角膜、咬伤处皮肤组织、脑组织等均可用于 病原学检测,其中以脑组织中的阳性率最高;血清和脑脊液可用于抗体的检测。(二)检测标本的要求6(三)实验前准备 1、实验室及仪器的准备(略) 2、各种试剂及材料的准备(略) 7实验室检测方法 (一)DFA 法 (二)巢式 PCR 法 (三)其它检测方法 (四)狂犬病诊断标准(WS281-2008)中的检测方法 (五)美国 CDC 狂犬病实验室操作手册中的检测方法 8(一)DFA 法(直接荧光抗体法)检测狂犬病毒抗原 免疫荧 光技术Ab优点Ag(尤其是不产生 细 胞病变的病毒安全快速简便敏感性和特 异性较高9荧光抗体的染色方法可分为两类: 直接法 荧光抗体直接与标本内的抗原反应,优点简便、快捷、有效减少非特异性染色,只适用于检测细胞内的抗原; 间接法 荧光抗体作为第二抗体,与直接结合胞内抗原的第一抗体反应,既可检测胞内抗原,也可以检测体液中的特异抗体相对直接法操作步骤增多DFA原理:抗体蛋白分子+ + 抗原形成抗原抗体复合物通过荧光显微镜检测抗原荧光素10操 作:1、材料和仪器 2、操作步骤 i. 印片: 用酒精浸泡载玻片 30 分钟后取出、吹干,分别取不同部位的脑组织剖面, 均匀的涂印在载玻片上;ii. 固定:吹干后,取冷丙酮(4)室温固定 710 分钟;取出吹干,进行步骤3,或置于 70冰箱保存; iii. 加荧光抗体:将稀释好的荧光抗体滴加在固定好的抗原片上(如果从 冰箱中取出,则待雾气散掉后再进行此步骤。); 11iv. 孵育:将抗原片放在湿盒中, 37温育30 分钟; v. 洗片:取出后,用缓流冲洗抗原片 35 秒,再用 PBS 振洗 2 遍,蒸馏水振洗 1遍,每次 2 分钟,吹干; vi. 封片镜检:用 90甘油( PBS)封片,加盖玻片,荧光显微镜观察。 搅拌器及染色缸 12结果判断:仔细观察每个视野的荧光强度,并结合不同视野的荧光分布,作出荧光强度的等级判断:阴性、可疑、 :无荧光; /:极弱的可疑荧光; 无荧光“” 13 :荧光较弱,但清晰可见;14 :荧光明亮,且多个视野均有分布;15 :荧光闪亮,可见尼基氏小体清晰,且 范围广泛;荧光强度“” 荧光强度“”1617(二)巢式 PCR 方法检测狂犬病毒核酸 传统的 PCR 检测模式一般需要三个步骤: 制备模板:对待测标本进行核酸(DNA或 RNA)提取 扩增过程:采用 PCR 或 RT-PCR 技术对核酸进行变性、退火、延 伸扩增; 检测过程:通过电泳等方法对PCR产物进行检测。 Sample Extract RNA or DNA PCR Electrophoresis photograph18巢式 PCR(nestedPCR):巢式 PCR的原理:是设计两对引物,其中一对引物在另一对引物扩增产物的片段上 ,通过二次 PCR 反应对某个基因进行检测。通常第一次采用能扩增较大片段的引物,经过循环扩增后,将第一次 扩增的产物作为模板进行第二次扩增。优点: 特异性、灵敏度均比常规 PCR好。缺点: 比常规 PCR易污染。19巢 式 PCR 方法的操作: 1、RNA 提取:Trizol 法 (1)以下步骤在 P2 生物安全柜中进行取不同位置的少量脑组织(50-100mg) 1000 l Trizol 先加 200 l(研磨均匀)然后加满至 1000 l 液体(唾液、尿液等)取 250 l 750 l Trizol LS -70过夜或颠倒 Epp 管 3040 次以便充分混匀内容物, 室温放置 5 分钟 (此步完可-70保存 1 个月) 20 (2) 以下步骤可在普通实验室进行 -70取出,室温融化加 200 l 氯仿, 快速颠倒 Epp 管数次(30 秒),使其呈淡粉红色 室温放置 3min 4离心,12000rpm,15min (其间标记新的离心管,每管中加 600 l 异丙醇) 取离心后水相 600 l,加入新的离心管中,轻柔混匀 室温放置 10 min (20放置 30 分钟效果更佳) 4离心,12000rpm,10min 21缓缓倒掉上清,用枪头轻轻吸去残存液体,可见少量沉淀 加 1ml 75乙醇(DEPC H2O 新鲜配制)洗涤沉淀 4离心 12000rpm,10min 缓缓倒掉上清,用枪头轻轻吸去残存液体,室温干燥数分钟 (加入 75乙醇至70可长期贮存 12 年) 脑组织的沉淀溶于 70ul DEPC H2O 中(2 个 EPP 管分装) 液体(唾液、尿液等)的沉淀 溶于 35ul DEPC H2O 中 直接进行逆转录或70贮存 22注意事项: 1. 操作时一定戴口罩手套,保证离心管枪头无 RNA 酶 2. 一次提取核酸,样本数不要太多(10 个左右) 3. 加入氯仿后到加入异丙醇之前的操作应尽量快速且作用时间准确, 否则容易降低提取效率 4. 异丙醇和乙醇作用时间略长不影响结果 5. 加入异丙醇后所有的混均操作要轻柔,加液体时贴壁缓流,以免破坏到所提核酸 6. 尽量缩短 RNA 在空气及室温的暴露时间,水溶的 RNA 一定要低温 保存 7. 标本及时放回-20或-70 232、逆转录合成cDNA1)pd(N)6 稀释至 0.2ug/ul2)水浴预热至 65(其间标记反应管) 3)33ulRNA 液 65水浴 10min(其间准备冰盒或碎冰)4)冰浴 2min,瞬时离心。5)将液体转移至试剂盒反应管中 32ul,先不要混匀。6)再向反应管中加入 1ul pd(N)6 0.2ug/ul 或特异引物各 0.5ul,使总体积达到 33ul,室温 1min,混匀,瞬时离心。 7)37水浴,60min 8) -20或-70保存 cDNA 243、巢 式 PCR:2526琼脂糖凝胶电泳 1电泳槽中注入缓冲液 TAE 2将做好的琼脂胶放入电泳槽(加样孔在负极方向) 3Marker 加 5 ul,样品加 10ul 5电压:100V6时间:30min 照相:凝胶成像仪/紫外透射仪27(三) 其它检测方法1、ELISA检测抗原:包被抗体:用pH 9.6 的碳酸盐缓冲液稀释的抗狂犬病毒核衣壳IgG 包被96 孔酶标板 ,4过夜; 封闭:用含0.3牛血清白蛋白和5% 蔗糖的pH9.6 碳酸盐缓冲液封闭30分钟; 加待检标本:将采集到的标本研磨,用pH 7.4 PBS制成30的悬液,离心取上清加 入酶标板孔内,同时设阴性、阳性对照,200 l/孔,37孵育1 小时; 洗板:洗板四次; 加酶标抗体:后加入纯化的酶标记抗狂犬病毒抗体200l/孔,37 l 小时; 洗板:同上; 加底物:加入酶反应底物,室温作用30 分钟; 终止反应:加2M H2SO4 终止反应; 观察结果:肉眼观察或酶标仪测定结果。282、荧光灶抑制试验检测中和抗体 中和抗体: 为疫苗免疫力程度的评判指标 中和抗体水平等于或高于0.5IU/ml 血清,表示能得到有效的保护 快速荧光灶抑制试验(RFFIT): 为WHO 推荐的检测方法 制备细胞悬液( 110 cells/ml 的 BSR 细胞悬液) 稀释血清和病毒(待测血清、对照血清、标准血清、病毒固定毒CVS 株)中和血清和病毒( 0.1ml血清 和标准病毒稀释液0.1 m1 ,37中和1.5 小时)检测剩余病毒(每孔加入 50 l 制备好的细胞悬液,37、5% C02 过夜培养)固定(弃掉培养液,PBS 洗一次,丙酮固定)荧光抗体检测(干燥后,加荧光素标记的抗狂犬病毒抗体,37 30 分钟)观察结果( PBS 洗3 次,荧光显微镜观察结果)计算中和抗体滴度(实验组中能使荧光灶抑制50的血清最高稀释倍数,即为被检血清的中和抗体滴度)步骤293、病毒分离A. 细胞培养法分离病毒 研磨标本 制成悬液(用PBS 或MEM ,30 ) 离心( 4 2000r/min 离心20 m) 取上清接种细胞(鼠神经瘤细胞、Vero 细胞 或BHK21 细胞) 吸附( 2 h) 加维持液 孵育(37 、5 C02 、45 天) 鉴定鉴定 B. 乳小白鼠接种法分离病毒 研磨标本 制成悬液 离心 取上清接种乳鼠脑内( 12 日龄 ) 饲养 观察发病情况观察发病情况( (未发病的鼠保留至21 天后作DFA检测)304、ELISA检测狂犬病毒抗体 ELISA方法测定的是总抗体,不代表具有保护性的中和抗体水平 其结果仅供参考。5、染色镜检检测内基氏小体31(四)狂犬病诊断标准(WS281-2008)中的检测方法1、DFA法检测狂犬病毒抗原 意义:阳性结果,表明有狂犬病毒感染,有确诊意义。2、ELISA检测狂犬病毒抗原 意义:检测到狂犬病毒抗原阳性有诊断意义。3、细胞培养方法分离狂犬病毒 意义:阳性结果表明有狂犬病毒感染,有确诊意义。324、RT-PCR检测狂犬病毒核酸原理:狂犬病毒为负链RNA病毒,PCR前需要经过逆转录酶作用,合成 一条cDNA链(RT),再进行PCR。 检测步骤:1)病毒RNA的提取2)逆转录合成cDNA3)PCR扩增4)电泳 意义:阳性结果表明有狂犬病毒感染,有确诊意义。335、狂犬病特异性抗体检测 狂犬病特异性抗体:在自然感染情况下,狂犬病毒通过带有病毒的动物唾液进 入机体伤口在入侵部位基本上不增殖(一般也不侵入血流) 故 不能形成病毒血症。在感染后,狂犬病毒或其抗原不能与机体免疫系统广泛接触 故机体无免疫应答反应(针对狂犬病毒
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