http: PPwww. chinacrops. orgPzwxbPE2mail : xbzw chinajournal. net. cn作 物 学 报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2007 ,33 (7) :1214 - 1218ISSN 049623490 ; CODEN TSHPA9研 究简 报 利 用 不 同 实 时 定 量 PCR方 法 分 析 相 对 基 因 表 达 差 异余 舜 武 1 刘 鸿 艳 1 罗 利 军 1 ,2 , 3 (1上 海 市 农 业 生 物 基 因 中 心 P作 物 遗 传 改 良 国 家 重 点 实 验 室 种 质 资 源 分 室 (上 海 ) ,上 海 201106 ;2华 中 农 业 大 学 ,湖 北 武 汉 430070)摘 要 : 利 用 实 时 荧 光 定 量 PCR 方 法 分 析 目 标 基 因 转 录 本 之 间 的 表 达 差 异 ,目 前 常 用 的 分 析 实 验 数 据 的 有 绝 对 定 量 和相 对 定 量 方 法 。 为 了 克 服 绝 对 定 量 方 法 的 繁 琐 和 简 化 相 对 定 量 的 分 析 方 法 ,分 别 利 用 2 - Ct 、 2 - Ct和 标 准 曲 线 法 对 水 稻OsRDB1 基 因 在 不 同 化 学 试 剂 和 激 素 处 理 下 的 表 达 差 异 进 行 了 分 析 ,发 现 2 - Ct必 须 引 入 标 准 的 看 家 基 因 作 为 参 考 ,计 算方 法 繁 琐 ,计 算 结 果 受 扩 增 效 率 影 响 ;而 利 用 2 - Ct和 标 准 曲 线 法 计 算 方 便 ,节 省 定 量 PCR 试 剂 ,但 其 结 果 易 受 到 RNA 浓度 测 量 准 确 率 的 影 响 ,其 中 标 准 曲 线 法 引 入 斜 率 消 除 扩 增 效 率 的 影 响 ,最 能 测 得 实 际 的 原 始 拷 贝 数 差 异 。关 键 词 : 相 对 定 量 ; 标 准 曲 线 ; 实 时 荧 光 定 量 PCR ; OsRDB1Analysis of Relative Gene Expression Using Different Real2Time Quantitative PCRYU Shun2Wu1 , LIU Hong2Yan1 , and LUO Li2Jun1 ,2 , 3(1 Shanghai Agrobiological Gene Center PGermsperm Resources Division (Shanghai) , National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement , Shanghai 201106 ;2 Huazhong Agricultural University , Wuhan 430070 , Hubei , China)Abstract : Real2time quantitative PCR is often used to analyze the target gene expression variation. The most commonlyused methods to analyze data from real2time quantitative PCR include two types : absolute quantification and relativequantification. To avoid the complex of absolute quantification and simplify the relative quantification , the methods of2 - Ct , 2 - Ct and standard curve were used to analyze the OsRDB1 expression variation under different chemical andhormone treatments in this study. The ratio of gene expression variation was calculated with the slope of standard curve.The results revealed that the 2 - Ct method had to be introduced a housekeep gene as a control , with a complicatedcalculation and the relative ratio was deviated by PCR amplification efficiency. The 2 - Ct and standard curve methods wereconvenient and saved chemicals used in the quantitative PCR , but the results were liable to the effect of the veracity of theRNA concentration. The modified method of standard curve introduced the curve slope to eliminate the effect ofamplification efficiency , and the result of standard curve method most closely revealed the diversity of original copy.Keywords : Relative quantification ; Standard curve ; Real2time quantitative PCR ; OsRDB1实 时 荧 光 定 量 PCR 是 最 近 几 年 新 发 展 起 来 的 方 法 ,具有 准 确 和 高 灵 敏 度 特 点 ,不 要 求 扩 增 后 电 泳 等 的 处 理 ,可 以节 省 时 间 ,有 效 消 除 实 验 室 PCR 产 物 如 核 酸 和 溴 化 乙 锭 等污 染 ,已 经 被 广 大 科 研 工 作 者 广 泛 应 用 于 农 作 物 转 基 因 和 基因 的 差 异 表 达 研 究 ,如 转 基 因 玉 米 检 测 1 和 水 稻 低 丰 度 表 达基 因 OsAMT1 ; 3 的 表 达 分 析 2 。 为 了 深 入 挖 掘 实 时 定 量PCR 的 优 越 性 ,发 展 了 多 种 分 析 实 验 数 据 的 方 法 3 。 检 测 基因 表 达 变 化 有 绝 对 定 量 和 相 对 定 量 两 种 方 法 。 绝 对 定 量 需要 借 助 其 他 手 段 和 方 法 标 定 RNA 的 绝 对 量 ,然 后 通 过 建 标准 曲 线 来 分 析 样 品 的 模 板 绝 对 量 425 ,方 法 复 杂 、 耗 时 、 成 本高 ,在 基 因 的 表 达 差 异 分 析 中 已 经 很 少 采 用 。 通 常 ,研 究 人员 关 注 的 不 是 目 标 转 录 本 的 拷 贝 数 ,而 是 该 基 因 在 不 同 外 界处 理 和 生 理 状 态 下 基 因 表 达 的 改 变 情 况 。 所 以 在 不 需 要 了解 样 品 绝 对 拷 贝 数 时 ,通 过 一 些 假 设 和 特 殊 的 公 式 直 接 推 导出 基 因 表 达 的 变 化 情 况 ,将 大 大 简 化 研 究 方 法 。 目 前 常 用 的相 对 定 量 方 法 2 - Ct 法 ,需 引 入 看 家 基 因 作 参 照 6 ;如 果 直接 与 未 处 理 的 样 品 作 比 较 ,可 以 使 用 2 - Ct 法 6 。 本 文 以SYBR GREEN 实 时 定 量 PCR 为 基 础 ,分 别 采 用 2 - Ct 、 2 - Ct和 修 改 的 标 准 曲 线 法 分 析 水 稻 基 因 OsRDB1 ( GenBankaccession No. DQ680143)在 不 同 化 学 试 剂 和 激 素 处 理 下 的 基因 表 达 变 化 情 况 。 OsRDB1 是 在 N 端 包 含 BURP 区 域 的 蛋 白基 因 7 ,能 够 响 应 各 种 激 素 和 胁 迫 处 理 8 。 为 了 有 效 减 少PCR 规 模 ,同 时 检 测 PCR 扩 增 效 率 ,将 传 统 的 绝 对 定 量 法 进行 了 修 改 ,即 将 处 理 样 品 中 的 一 个 样 品 分 别 稀 释 10 104 基 金 项 目 : 上 海 市 青 年 科 技 启 明 星 计 划 项 目 (06QA14045)作 者 简 介 : 余 舜 武 (1971O) ,男 ,博 士 ,副 研 究 员 。 3 通 讯 作 者 (Corresponding author) :罗 利 军 ,男 ,博 士 ,研 究 员 ,E2mail : lijun sagc. org. cnReceived (收 稿 日 期 ) : 2006208223 ; Accepted (接 受 日 期 ) : 2006212219.倍 ,然 后 构 建 标 准 曲 线 ,利 用 标 准 曲 线 的 斜 率 比 较 每 一 个 样品 的 拷 贝 变 化 率 。 结 果 表 明 该 方 法 不 仅 能 准 确 反 映 基 因 的PCR 扩 增 效 率 ,而 且 与 2 - Ct法 获 得 一 致 的 试 验 结 论 ,能 有 效应 用 于 水 稻 基 因 的 相 对 定 量 研 究 。 此 外 本 文 还 比 较 了 三 种方 法 之 间 的 实 验 限 制 因 子 。1 材 料 与 方 法111 材 料水 稻 品 种 沪 旱 3 号 发 芽 后 ,移 植 于 液 体 培 养 基 (自 来 水配 制 成 1P5MS大 量 元 素 ) 。 幼 苗 生 长 15 d 后 ,分 别 用 3 种 不同 浓 度 的 NaCl、 H2O2 、 水 杨 酸 (SA) 和 甘 露 醇 处 理 1 h ,然 后 剪取 叶 片 ,快 速 投 入 液 氮 保 存 ,用 于 RNA 的 抽 提 。112 实 验 方 法11211 无 DNA 的 总 RNA 制 备 按 上 海 华 舜 生 物 技 术 有限 公 司 提 供 的 植 物 叶 RNA 小 量 抽 提 试 剂 盒 使 用 说 明 书 抽提 。 使 用 Beckman CoulterTM DUR 640 紫 外 分 光 光 度 计 测 定RNA 浓 度 。 为 除 去 残 留 在 RNA 中 的 DNA ,每 个 总 RNA 样 品取 5 g ,加 入 1 L DNAase (美 国 Invitrogen 公 司 ) 和 1 L10 反 应 缓 冲 液 ,补 足 体 积 至 10 L ,常 温 反 应 30 min ,然 后 每管 加 入 1 L 2 mmol L - 1 EDTA 终 止 反 应 ,最 后 在 70 加 热10 min使 DNAase 失 活 。11212 第 一 链 cDNA 的 合 成 将 上 述 RNA 样 品 各 取 2 L ,按 美 国 Promega 公 司 反 转 录 试 剂 盒 提 供 的 试 剂 依 次 添 加 4 L25 mmol L - 1 MgCl2 ,2 L 10 RT缓 冲 液 ,2 L dNTP混 和 液