第四节 噬菌体抗体工程一、噬菌体展示技术基本原理抗体库技术抗体库在原核系统功能性表达多样性抗体基因(repertoire)通过多种选择手段筛选出特定性能的抗体基因抗体库技术产生的三项技术基础uRT-PCR：能够克隆全套抗体可变区基因u噬菌体展示技术（phage display) u抗体基因片段在大肠杆菌的功能性表达一、基本原理模拟体内B细胞产生抗 体的过程可绕过免疫直接制备 全人源性抗体接头DNAVH VL噬菌体表面呈现的小分子抗体 基因III或 基因VIII 外壳蛋白 VHVL抗体库的构建抗体库的构建抗体库的富集筛选二、噬菌体抗体库（一）噬菌体抗体库种类1.天然抗体库：来源于未经免疫的供体。代表天 然抗体在供体内的抗体谱，亲和力低2.免疫抗体库：来源于经免疫的供体。亲和力高 ，多样性低3.半合成抗体库：CDR1和CDR2来自人胚系，CDR3 随机合成。库容大，亲和力低。4.合成抗体库：VH和VL基因合成VH PoolVL PoolscFv Pool105 DNA Sequences105 DNA SequencesRandomly Ligate Combinatorial（二）噬菌体抗体库的表达载体1.lamda噬菌体2.丝状噬菌体3.噬菌粒一、 抗体库技术1.获取目的基因：RT-PCR2.抗体库技术的载体：噬菌粒（phagemid）载体3.淘筛（panning）：用固相化抗原对表达产物 的载体进行淘筛，淘汰非目的克隆，使目的克隆 大量扩增。4.表达与鉴定：目的克隆经过鉴定后，再导入感 受态菌株，进行可溶性表达，其产物用Western blot分析确定后，就完成了全过程。（三）噬菌体抗体库的构建方法Phage Display of Fab To Optimize AntibodiesGene IIICH1VHCLVLVLVHGene IIIExpression Plasmid - “Phagemid”Escherichia coliPeptide DisplayNew England Biolabs PhD SystemE. coli109 different 7-mer peptides Ca. 100 copies each/assay设计VH/VL或L链/Fd链基因上、下游引物进行RT-PCR将PCR产物VH/VL或L链/Fd链重组到粘粒或杆状噬菌 体载体中建立文库近年来PCR技术的发展简化了获取可变区基因的过程，用5端前导顺序或框架区引物及3端恒定 区域V基因中的J区引物，可以从很少量的细胞中 扩增得到可变区片段，PCR产物能直接克隆到表达 载体上。通常针对不同的VH和VL家族采用不同的 引物。109different phagef1 oriAmprRE1 (xxxn) RE2gene VIII(xxx)nPhage-displayed Peptide LibrarySelection From Library of Random MutantsRandom Library of DNA SequencesGene 3 or 8+Gene 3 FusionsEach Phage Displays One Peptide SequenceTranslated from DNA to Peptide in E. coli筛选（1）表位筛选纯抗原筛选全细胞或裂解液进行筛选（2）功能性筛选：生物学功能，如抗体酶（3）选择性感染筛选：噬菌体感染能力的 恢复1.固相或液相纯抗原的筛选、2.全细胞筛选、3.切片组织筛选E. coliSequence Fusion DNAReplicate Amplify“Winners”InfectPurify噬菌体表面展示文库技术的要点: 外源基因表达多肽以融合蛋白形式展示在外壳蛋白N端将基因组合文库插入噬菌体编码膜蛋白的基因g3或g8 的先导系列的紧靠下游随机克隆入相应载体形成组合文库从免疫或未被免疫的B细胞中PCR扩增抗体全套基因片段用固相化抗原经“亲和结合一洗脱一扩增”数个循环直 接、方便、简捷、高效地筛选出表达特异性好、亲和 力强的抗体噬菌体库。使翻译出的抗体分泌到细菌的质周腔内，形成游离的 抗体片段，经过纯化即可获得目的抗体。筛选到的噬菌体再将基因g3或g8切除后，转入大肠杆 菌，三、噬菌体抗体库技术的特点及应用1、建立具有相当容量的抗体库：组合库2、避开了人工免疫和杂交瘤技术：抗体库的大容量和极高的 筛选效率，可以调出任意抗体基因，用基因工程方法制备抗体 ，因而能避免使用人工免疫动物和细胞融合技术。3、适合工业化生产：用细菌操作4、模拟天然全套抗体库：1011库容，包含B细胞全部克隆。来 自人体外周血、骨髓或脾脏的淋巴细胞提取的mRNA反转录的 cDNA扩增，是人体多克隆细胞的总mRNA。使用的通用引物采自 多个人体，具有人的种属普遍性。抗体的VH和VL基因的随机重 组也增加了抗体的多样性。5、抗体表型与基因型一致6、筛选后得到的人源化可变区抗体，无异种蛋白反应可获得高亲和力的人源化抗体：在噬菌体抗体库中，VH和 VL基因的随机重组模拟了体内抗体亲和力成熟的过程，所 用的抗体基因又来自人体，因此，所产生的抗体必然都是 高亲和力的人源化抗体。宿主细胞: 杂交瘤 细菌 筛选范围 : 103 107109 时间: 几个月 几周 操作: 繁杂 相对简 单 免疫: 必须 可避免 人源抗体: + 费用: 高 低 生产量: 有限 无限 基因获取: 再克隆 直接应用前景: 有限 不可估 抗体库介绍英国剑桥抗体技术公司（Cambridge Antibody Technology, CAT），现被英国MedImmune公司收购。CAT是噬菌体展示技术领域的领先者，其抗体基因来源于健康人的血液细胞，已经建立了库容为1011噬菌体文库。通过结合全自动装置和基因组技术，进行高通量分离和筛选。CAT还建立了自动化的培养基通量克隆、转染和纯化系统，用于将ScFv转变成完整的IgG。CAT上市产品有抗TNF-的阿达木单抗（Adalimumab，HUMIRA）；处于期临床试验的抗IL-12和IL-23的Briakinumab（ABT-874.）；美国Dyax公司建立了的半合成Fab噬菌体抗体库，库容为 3.51010。该抗体库的重链CDR1和CDR2序列为合成引物克隆 的，重链CDR3序列和轻链基因来源于人的B细胞。该抗体库 目前处于临床试验期的产品有抗VEGFR2的Ramucirumab (IMC-1121B)和抗EGFR的MC-11F8*；德国MorphoSys AG公司建立了一个人组合抗体库(Human Combinatorial Antibody Library，HuCAL)。HuCAL的基因 都是通过合成得到的，该公司已经建立了库容为1.61010的 Fab噬菌体抗体展示文库。：抗A40/42的Gantenerumab等噬菌体展示技术的应用现状 1. 抗体：抗狂犬病毒的单链抗体，抗HIV-1囊膜糖蛋白的单链抗体，此抗体可专一性杀死被HIV-1感 染并表达有gp120的淋巴细胞, 中和响尾蛇毒素 的单链抗体，等等。 2.疫苗：展示在噬菌体表面的HIV-1 的gp120-V3 环 可象天然抗原一样引起显著的免疫应答, 等等3. 多肽类药物：如一些激动剂或拮抗剂从多肽库中分离鉴定 出来；已获得一13 肽，它能中和蛇毒 - bungarotoxin；从CX7C 多肽库中掏选到一个多肽 能与 Hantavirus 结合，并使该病毒不能结合或 感染细胞。人血管促生素（angiogenin）是一种 能促进肿瘤血管生长的蛋白，用这个蛋白去淘选 一个噬菌体展示多肽库，所获得的一个环状8肽能 与血管促生素结合，并能阻遏血管促生素的活性 等等。4.肿瘤药物导航载体：用肿瘤细胞特殊的受体蛋白从展示文库中淘选到的多肽或单链抗体，可以作为抗癌药物的定 向输送工具 。一个成功的实例是：将噬菌体多 肽展示库注射入具有肿瘤的小鼠体内，然后杀死 小鼠，取出肿瘤，再将结合其上的噬菌体洗脱下 来。展示在其上的多肽具有与该肿瘤的特异性亲 和力。将此多肽与细胞毒素 doxorubicin 偶联 。结果显示，此偶联物具有更强的抑制肿瘤的效 果.已上市的有阿达木单抗Humira (adalimumab, D2E7)，第一个全人单抗（2002）从事全人源抗体开发的英国剑桥抗体技术公司 (CAT)和Abbott Laboratories公司采用的噬菌体 展示技术，筛选的抗TNF-（D2E7）全人抗体。Humira用于治疗类风湿性关节炎 目前噬菌体抗体库技术也存在不足之处如从未经免疫动物的抗体库获得的抗体亲和力不高、受外源基因转化率的限制、抗体库的库容不 足以涵盖一些动物的抗体多样性等因此，大容量抗体库是获得高亲和力抗体和针对稀有抗原抗体的关键第五节 转基因动物表达抗体（一）分泌完全人源化抗体转基因鼠的建立噬菌体抗体库技术得到的是小分子人源化抗体，不能得到完整抗体1994年美国Cell Genesys公司和Genpharm国 际公司同时得到转人抗体基因小鼠 (human antibody mouse，HuMab)将小鼠Ig基因敲除，转染人Ig基因，在小鼠体内 产生人Ab，再经杂交瘤技术，产生大量完全人源化抗体（1997年）Xenomouse（Abgenix）含1020 kb人Ig重链和800 kb的人Ig轻链基因的基因敲除小鼠。Xenomouse含大多数人重链(66/95 VH)和K轻链 (32/76 VL)可变基因、全部D区和JH区、人重链和 K(CK)恒定区及已知与Ig有关的多数调控元件Xenomouse建立了较强的体 液免疫功能。能诱导类似于人类的多样性初次免疫 应答。用人抗原再次免疫 Xenomouse可发生强烈的二 次免疫应答，产生高亲和性的人Ig单抗XenoMouse Technology: Over 6 Years of Proven SuccessMouse Ab Genes InactivatedXenoMouse MiceHuman Ab Genes Introduced凯龙公司（Chiron），Genentech、辉瑞公司（ Pfizer）安进公司Amgen得到Abgenix 公司的XenoMouse授权的专利技术目前，用XenoMouse小鼠产生的人单抗有抗EGFR、 IL-8、TNF-a、IL-6、L-selectin和CD147等Abgenix公司采用XenoMouse得到的针对EGFR的人 抗体(panitumumab，ABX-EGF) 已经上市帕尼单抗(Panitumumab) :靶向表 皮生长因子受体(EGFR)的