1试验一 外周血白细胞中DNA的提取与检测21.掌握真核细胞中DNA制备原理。2.熟悉从外周血白细胞中提取DNA的方法。3.掌握紫外分析仪检测DNA的原理。一、实验目的 3二、实验原理 破碎细胞DNA提取检测STMT破碎红细胞及白细胞的细胞膜离心收 集白细胞核SDS破膜苯酚氯仿抽提、乙醇沉淀洗涤琼脂糖凝胶电泳，紫外分析仪检测4三、仪器试剂 1、主要器具Eppendorf离心管电泳槽与电泳仪紫外分析仪台式离心机微量移液器52、主要试剂STMT：（蔗糖、Tris-HCl、MgCl2、TritonX-100） NE： （NaCl、EDTA Na2） TE： （Tris-HCl、 EDTA Na2 ）SDS 苯酚 氯仿 乙醇：无水乙醇、70%乙醇6四、操作步骤 吸去血清，混匀含有EDTA Na2的抗凝全血取0.3mL至EP管（1）加1mLSTMT，混匀 离心（12000rpm 1-2min），弃上清加1mL0.9% NaCl洗涤离心,弃上清（12000 rpm 1-2min）加460 L NE ,充分吹散沉淀加35 L 10%SDS，轻轻混匀。1、破碎细胞：2、DNA提取：加等体积苯酚，轻摇1min离心（12000rpm 3-5min）吸取上层水相于另一EP管（2 ） 加1/2体积苯酚+1/2体积氯仿-异戊醇，轻摇1min 离心（12000rpm 1min）取上 层水相于另一EP管（3）加等体积氯仿-异戊醇离心（12000rpm 1min） 取上层 水相于另一EP管（4） 3、沉淀DNA加1/10体积3M NaAC，混匀加1mL无水冰乙醇置-20冰箱，0.5-1h 离心 （12000rpm 5min） 弃上清加70%冷乙醇1mL洗涤离心（12000rpm 5min） 弃上清自然干燥加50 L TE溶解，室温1h。74、电泳制胶：0.8%的琼脂糖凝胶（琼脂糖0.32g+TBE40ml，混合，加热熔化 ，冷至60，加EB20 L,制胶）加样：DNA样品10 L +载样缓冲液2 L，混匀，取10 L点样 电泳：点样端接负极，100V，40min紫外分析仪下观察结果8电泳结果图9五、注意事项 1、注意安全（苯酚具有强腐蚀性），操作戴手套； 2、所用玻璃器皿及溶液需经高压灭菌处理； 3、混匀试剂、吸取上清等操作时应动作要轻柔,避免动作剧烈； 4、离心分离两相时，应保证一定的转速和时间，且吸取上清时注意不要吸取到中间层及有机相； 5、沉淀后注意不要将DNA沉淀倒掉。10谢 谢 各 位