1第第 3636 讲讲 基因工程基因工程 考纲要求 1.工具酶的发现和基因工程的诞生加试(a)。2.基因工程的原理和技术加试(b)。3.基因工程的应用加试(a)。4.活动：提出生活中的疑难问题，设计用基因工程技术解决的方案加试(c)。考点一考点一 基因工程的诞生、操作工具基因工程的诞生、操作工具1基因工程的含义(1)概念：把一种生物的遗传物质(细胞核、染色体脱氧核糖核酸等)移到另外一种生物的细胞中去，并使这种遗传物质所带的遗传信息在受体细胞中表达。(2)核心：构建重组 DNA 分子。2基因工程的基本工具思考诊断1已知限制性核酸内切酶EcoR和Sma识别的碱基序列和酶切位点分别为 GAATTC 和CCCGGG，两种限制性核酸内切酶切割 DNA 后产生的末端如下。EcoR限制性核酸内切酶和Sma限制性核酸内切酶识别的碱基序列不同，切割位点不同(相同/不同)，说明限制性核酸内切酶具有专一性。2观察下图所示过程，回答需要的工具酶及相关问题：(1)是限制性核酸内切酶；是 DNA 连接酶；二者的作用部位都是磷酸二酯键。2(2)限制性核酸内切酶不切割自身 DNA 的原因：原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。3载体须具备的条件及其作用(连线)4限制性核酸内切酶Mun I 和限制性核酸内切酶EcoR的识别序列及切割位点分别是CAATTG和GAATTC。如图表示四种质粒和目的基因，其中，箭头所指部位为限制性核酸内切酶的识别位点，质粒的阴影部分表示标记基因。适于作为图示目的基因载体的质粒是下列中的哪一个？提示 由图可知，质粒上无标记基因，不适合作为载体；质粒和的标记基因上都有限制性核酸内切酶的识别位点。只有质粒上既有标记基因，且Mun的切割点不在标记基因上。题型一 基因工程的原理、操作工具1下列关于载体的叙述中，错误的是( )A载体与目的基因结合后，实质上就是一个重组 DNA 分子B对某种限制性核酸内切酶而言，载体最好只有一个切点，但还要有其他多种酶的切点C目前常用的载体有质粒、 噬菌体和动植物病毒D载体具有某些标记基因，便于对其进行切割答案 D解析 载体必须具备的条件有：对受体细胞无害，不影响受体细胞正常的生命活动；具有自我复制能力，或能整合到受体细胞的染色体 DNA 上，随染色体 DNA 的复制而同步复制；具有一个至多个限制性核酸内切酶切点，以便目的基因可以插入到载体中；带有特殊的标记基因，如抗生素抗性基因，以便于对外源基因是否导入进行检测；载体 DNA 分子大小适合，以便于提取和进行体外操作。32若要利用某目的基因(见图甲)和 P1噬菌体载体(见图乙)构建重组 DNA(见图丙)，限制性核酸内切酶的酶切位点分别是Bgl (AGATCT)、EcoR (GAATTC)和Sau3A (GATC)。下列分析合理的是( )A用EcoR切割目的基因和 P1噬菌体载体B用Bgl和EcoR切割目的基因和 P1噬菌体载体C用Bgl和Sau3A切割目的基因和 P1噬菌体载体D用EcoR和Sau3A切割目的基因和 P1噬菌体载体答案 D解析 解答本题的关键是要看清切割后目的基因插入的方向，只有用EcoR和Sau3A切割目的基因和 P1噬菌体载体，构建的重组 DNA 中 RNA 聚合酶在插入的目的基因上的移动方向才一定与图丙相同。前挂后连几种易混淆酶的比较名称功能应用限制性核酸内切酶特异性地切断 DNA 链中的磷酸二酯键重组 DNA 技术和基因诊断DNA 连接酶连接 DNA 片段之间的磷酸二酯键基因工程DNA 聚合酶连接 DNA 片段与单个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键DNA 复制RNA 聚合酶连接 RNA 片段与单个核糖核苷酸之间的磷酸二酯键RNA 复制和转录逆转录酶作用于磷酸二酯键以 RNA 为模板获得 DNADNA 解旋酶使碱基对之间的氢键断裂DNA 复制DNA 水解酶使 DNA 分子所有磷酸二酯键断裂水解 DNA题型二 基因工程的技术3大肠杆菌 pUC18 质粒是基因工程中常用的载体。某限制性核酸内切酶在此质粒上的唯一酶切位点位于 LacZ 基因中，如果没有插入外源基因，LacZ 基因便可表达出 半乳糖苷酶。当培养基中含有 IPTG 和 Xgal 时，Xgal 便会被 半乳糖苷酶水解成蓝色，大肠杆菌将形成4蓝色菌落。反之，则形成白色菌落。下图表示利用此质粒实施基因工程的主要流程。请分析并回答问题。(1)对已获得的目的基因可利用_技术进行扩增。(2)目的基因插入质粒构建重组质粒的过程中，需要 DNA 连接酶恢复_键。(3)将试管中的物质和大肠杆菌共同置于试管的目的是_；大肠杆菌需事先用 Ca2进行处理，目的是_。(4)将试管中的菌液接种于选择培养基上，培养基中加入氨苄青霉素的作用是筛选出_。(5)若观察到培养基上出现_色菌落，则说明大肠杆菌中已成功导入了重组质粒。如果作为受体细胞的大肠杆菌也含有 LacZ 基因，则不利于重组质粒的筛选，原因是_答案 (1)PCR(2)磷酸二酯(3)进行转化 使大肠杆菌细胞处于感受态(4)导入 pUC18 质粒的大肠杆菌(5)白 无论大肠杆菌中是否导入重组质粒，均会呈现蓝色菌落考点二考点二 基因工程的操作步骤、应用及相关的设计方案基因工程的操作步骤、应用及相关的设计方案1基因工程的操作步骤(1)获得目的基因获取目的基因序列已知：化学合成或 PCR 扩增；基因序列未知：从基因文库中获取。(2)形成重组 DNA 分子(基因工程的核心)：通常用相同的限制性核酸内切酶分别切割目的基因和载体 DNA，然后用 DNA 连接酶将目的基因和载体 DNA 连接在一起，形成重组 DNA 分子。(3)将重组 DNA 分子导入受体细胞常用的受体细胞：大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌和动植物细胞等。导入方法：用氯化钙处理大肠杆菌，可以增加大肠杆菌细胞壁的通透性，使重组质粒容易5进入。(4)筛选含有目的基因的受体细胞筛选原因：并不是所有的细胞都接纳了重组 DNA 分子，因此，需筛选含目的基因的受体细胞。筛选方法：用含抗生素的培养基培养受体细胞，选择含重组质粒的受体细胞。(5)目的基因的表达目的基因在宿主细胞中表达，产生人们需要的功能物质。2基因工程的应用(1)基因工程与遗传育种转基因植物培育优点Error!转基因动物Error!(2)基因工程与疾病治疗基因工程药物：如通过大肠杆菌生产胰岛素治疗糖尿病，通过酵母菌生产乙肝疫苗等。基因治疗指的是向目标细胞中引入正常功能的基因，以纠正或补偿基因的缺陷，达到治疗的目的。(3)基因工程与生态环境保护利用转基因植物生产聚羟基烷酯，用于合成可降解的新型塑料。改造分解石油的细菌，提高其分解石油的能力。利用转基因微生物吸收环境中的重金属，降解有毒化合物和处理工业废水。思考诊断1基因表达载体的组成及各部分的作用(连线)2据图选择相关的限制性核酸内切酶基因工程中，需使用特定的限制性核酸内切酶切割目的基因和质粒，便于重组和筛选。已知限制性核酸内切酶的识别序列和切点是GGATCC；限制性核酸内切酶的识别序列和切点是GATC。6请据图分析：切割目的基因应选择限制性核酸内切酶，切割质粒应选择限制性核酸内切酶。3完成下列填充(1)原核生物作为受体细胞的优点：繁殖快；多为单细胞；遗传物质相对较少。(2)转化的实质是把目的基因整合到受体细胞基因组中。4补充目的基因检测与鉴定的方法示意图5如图为抗虫棉的培育过程，请据图回答下列问题：(1)该基因工程中的目的基因和载体分别是什么？一般情况下，为什么要用同一种限制性核酸内切酶处理目的基因和载体？提示 目的基因是 Bt 毒蛋白基因，载体是 Ti 质粒。用同一种限制性核酸内切酶处理目的基因和载体，可以获得相同的粘性末端，便于形成重组 DNA 分子。(2)该实例中为什么目的基因可以整合到染色体的 DNA 上？提示 由于 Ti 质粒上的 TDNA 可转移到受体细胞且能整合到受体细胞的染色体 DNA 上，而目的基因又插入到了 TDNA 上，所以目的基因可以整合到受体细胞的染色体 DNA 上。(3)该实例中，检测目的基因是否表达常见的方法是什么？提示 用棉叶饲喂棉铃虫。7题型一 基因工程的操作程序1下面为大肠杆菌及质粒载体的结构模式图，据图回答下列问题：(1)a 代表的物质和质粒的化学本质都是_，二者还具有其他共同点，如_，_(写出两条即可)。(2)若质粒 DNA 分子的切割末端为，则与之连接的目的基因切割末端应为_；可使用_把质粒和目的基因连接在一起。(3)氨苄青霉素抗性基因在质粒 DNA 上称为_，其作用是_。(4)下列常在基因工程中用作载体的是( )A苏云金芽孢杆菌抗虫基因B土壤农杆菌环状 RNA 分子C大肠杆菌的质粒D动物细胞的染色体答案 (1)DNA 能够自主复制 具有遗传特性(2) DNA 连接酶(3)标记基因 供重组 DNA 的鉴定和选择(4)C解析 (1)a 代表的物质是拟核 DNA 分子，质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核之外的小型环状 DNA 分子，两者都能自主复制，并蕴含遗传信息。(2)质粒 DNA 分子的切割末端能够与目的基因切割末端发生碱基互补配对，可使用 DNA 连接酶将它们连接在一起。(3)质粒 DNA 分子上的氨苄青霉素抗性基因可以作为标记基因，便于对重组 DNA 进行鉴定和筛选。(4)作为载体必须具备的条件：在宿主细胞中能保存下来并能大量复制；有多个限制性核酸内切酶切点；有一定的标记基因，便于筛选。常用的载体有质粒、 噬菌体、动植物病毒等。苏云金芽孢杆菌抗虫基因一般作为目的基因；土壤农杆菌环状 RNA 分子不容易在宿主细胞内保存；动物细胞染色体的主要成分是 DNA 和蛋白质，不能被限制性核酸内切酶切8割，因此不能用作载体。2(2015诸暨中学统考)科学家将外源目的基因与大肠杆菌的质粒进行重组，并在大肠杆菌中成功表达。下图表示构建重组质粒和筛选含目的基因的大肠杆菌的过程。请据图回答问题：(1)步骤和中常用的工具酶是_和_。(2)经过和步骤后，有些质粒上的_基因内插入了外源目的基因，形成重组质粒。(3)步骤是_的过程。为了促进该过程，应该用_处理大肠杆菌。(4)步骤是将三角瓶内的大肠杆菌接种到含有四环素的培