微生物学实验指导教师：任晓冬 单亚明 实验流程土壤样品中微生物的分 离纯化细菌酵母菌霉菌放线菌形态结构观察生理生化反应nisin效价测定生长曲线测定形态观察死活细胞鉴定直接计数测微技术形态结构观察培养菌种保藏土壤中微生物的分离纯化、培养 观察及保藏 相关理论知识（1）l微生物的分离与纯化从混杂的微生物群体中获得只含某一种或某 一株微生物的过程。 l常用的分离、纯化方法微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落 ，通常是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此 可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获取单 个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线 等技术完成。土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏 相关理论知识（2）l土壤生境土壤是微生物生活的大本营，所含微生物无 论数量还是种类都极其丰富,因此,土壤是微生 物多样性生长的重要场所，是发掘微生物资源 的重要基地，可以从中分离、纯化得到许多有 价值的菌株。本实验将采用不同的培养基从土 壤中分离不同类型的微生物。 土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏 相关理论知识（3）l乳酸菌乳酸菌是一类能在碳水化合物发酵过程中产 生大量乳酸的细菌，在酸奶中大量存在。l乳酸菌形态球形、类球状、短杆或杆状，有些细胞有芽 孢。l代谢产物以乳酸为主要代谢产物，有些乳酸菌可以产 生乳链菌肽（Nisin)，乳链菌肽有抑菌活性。土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏 目的要求1、了解微生物分离和纯化的原理 。 2、掌握常用的分离纯化微生物的方法。 3、掌握倒平板的方法。 4、进一步熟练和掌握微生物的无菌操技术。 5、掌握微生物的培养方法。 土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏 实验原理（1）l微生物分离与纯化从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某 一株微生物的过程。l平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理 是选择适合于微生物生长的培养条件（如营养 成分、酸碱度、温度和氧等,或加入某种抑制剂 ），在平板上培养微生物，当平板上长出单菌 落后，挑取，得到纯种的微生物 土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏 实验原理（2）l分离产Nisin的乳酸乳球菌时，要用选择性平板能够产生Nisin的乳酸菌，自身会有对一定 浓度的Nisin 的抗性，而很多其它的细菌不具 有这种抗性。所以，在纯化乳酸乳球菌时，要 在平板中加入一定量的Nisin,使得对Nisin没有 抗性的其它细菌被抑制，平板中的单菌落就有 更大的可能性是我们需要的乳酸乳球菌l采用在平板中加入抑制剂的方法是微生物学常 用的分离纯化微生物的方法。土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏 试剂与器材1、材料含大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉、根霉、 青霉和放线菌的土壤样品及酸奶样品，牛肉膏 蛋白胨培养基（斜面、液体、半固体）、马丁 氏培养基、查氏培养基等 2、试剂10%酚、4%水琼脂 3、器材盛9mL无菌水的试管、盛90mL无菌水并带有玻璃 珠的三角瓶、涂布器、无菌吸管、接种环，酒 精灯、无菌培养皿、显微镜、细胞计数板等。土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏 牛肉膏蛋白胨培养基 l牛肉膏 3gl蛋白胨 10glNaCl 5gl琼脂 15-20gl用水定容至 1000mllpH 7.0-7.2l用于分离细菌土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏 查氏培养基 lNaNO3 2glK2HPO4 1glKCl 0.5glMgSO4 0.5glFeSO4 0.01gl蔗糖 30gl琼脂 15-20gl用水定容至 1000mll用于分离霉菌土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏 高氏一号培养基 l可溶淀粉 20g lKNO3 1glNaCl 0.5glK2HPO4 0.5glMgSO4 0.5glFeSO4 0.01gl琼脂 15-20gl用水定容至 1000mllpH 7.2-7.4l用于分离放线菌土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏 马丁氏培养基 l 葡萄糖 10gl 蛋白胨 5gl K2HPO4 1gl MgSO4 0.5gl FeSO4 0.01gl pH 自然l 用水定容至 800mll 用于分离酵母菌土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏 M17培养基l蛋白胨 10 gl酵母粉 5 gl抗坏血酸 0.5 gl牛肉膏 2.5 glMgSO4 7H2O 0.01 gl磷酸氢二钠 19 g l0.04% 溴甲酚紫 16mll用水定容至 1000ml l乳链菌肽（Nisin) 250ml Nisin/1000ml培养基（Nisin单独灭 菌) l用于分离酸奶中的乳酸乳球菌 l从酸奶中分离乳酸乳球菌的操作与从土壤中分离细菌操作相同 土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏 实验步骤土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏 倒平板土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏 菌悬液的配制 土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏 菌液的稀释土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏 接 种土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏 培 养土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏 微生物的纯种培养土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏 注意事项1、接种环要灼烧灭菌。接触菌体前要冷却。接种后要在火焰上灼烧。 2、实验在洁净工作台内进行，操作时菌体不 应和火焰太过接近。 3、本实验要严格地按照无菌操作进行。 4、培养时要倒置培养，防止染菌。 5、取单菌落时不要碰到其它的菌落。土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏 细菌的形态结构观察相关理论知识l细菌形态群体的形态细菌菌落大多表面光滑湿润，有光泽，一般菌落较 小，质地颜色均匀，同培养基结合不紧密。菌落特征与 组成菌落的细胞结构、生长状况、排列方式、好气性和 运动性直接相关。个体的形态主要分为球菌、杆菌、螺旋菌三大类，近年还发现 星状和四方形细菌等。细菌形态随培养时间、培养基成 分、浓度、培养温度、培养时间等发生变化。细菌个体微小，较透明，必须染色方可呈现。根据 细菌个体形态观察的不同要求，可将染色分为简单染色 、鉴别染色、特殊染色三种类型。细菌的形态结构观察目的要求1、显微镜下观察细菌个体的形态。 2、学习环境中微生物的检查方法，并加深对微生 物分布广泛性的认识。 3、了解简单染色法的原理，并掌握其操作方法 4、学习并掌握微生物涂片、染色的基本技术和无 菌操作技术。 5、巩固显微镜的油镜的使用方法。 6、初步认识细菌的形态。细菌的形态结构观察简单染色法原理简单染色是利用单一染料对细菌进行染色 。细菌在中性、碱性或弱酸性溶液环境中通常 带负电荷，碱性染料（解离时分子的染色部分 带正电荷）如美兰、结晶紫等易与细菌结合使 其着色。细菌的形态结构观察试剂与器材1、材料枯草芽孢杆菌、大肠杆菌及乳酸乳球球菌 2、试剂吕氏碱性美蓝染液或草酸铵结晶紫染液 3、器材显微镜、酒精灯、载玻片、盖玻片、双层瓶（ 内装香柏油及二甲苯）、擦镜纸、生理盐水等。细菌的形态结构观察实验步骤l涂片l干燥：室温自然干燥l固定：通过火焰23次，细胞质凝固l染色：滴加染液l冲洗：水洗至无色l干燥：自然，吹干，吸干l镜检细菌的形态结构观察注意事项l涂片时水滴不要太大，菌体最好涂成一个薄膜 。要求涂布均匀。l室温自然干燥。l固定时, 通过火焰23次，不可以加热过久。l染色时, 滴加染液覆盖上菌体薄膜即可。l冲洗时, 水洗至无色，要注意水流要有一个角 度，从载片的一端自然流到另一端，但是水流 要通过染色过的菌体薄膜。水流不宜过大，防 止将菌体冲走。l镜检时，油镜与普通的物镜要严格地按照操作 规程执行。细菌的形态结构观察细菌的革兰氏染色相关理论知识l革兰氏染色法它是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法 ，1884年由丹麦医师Gram创立。l菌种鉴定的重要手段革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰 氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类 ，它是细菌学上最常用的鉴别染色法。细菌的革兰氏染色目的要求1、初步掌握细菌涂片方法及革兰氏染色法步骤 。 2、学习并掌握芽孢染色法 3、掌握革兰氏染色法的原理。细菌的革兰氏染色革兰氏染色实验原理革兰氏染色能将细菌分为G+菌和G-菌，是 由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定 的。G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的 类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用 乙醇或丙酮脱色时溶解类脂质，增加了细胞壁 的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于 渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后变 成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高 ，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚 糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保 留初染时的颜色。细菌的革兰氏染色试剂与器材1、材料乳酸乳球菌、枯草芽孢杆菌。 2、试剂结晶紫染液、碘液、95%乙醇、番红等。 3、器材显微镜、酒精灯、载玻片、盖玻片、双层瓶（ 内装香柏油及二甲苯）、擦镜纸、生理盐水等。细菌的革兰氏染色革兰氏染色实验步骤l制片：取菌种培养液常规涂片，干燥，固定。 l初染：滴加结晶紫，染色12min，水洗；l媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min, 水洗；l乙醇脱色：滤纸吸去残水，倾斜玻片用95乙 醇洗涤脱色至无色，立即水洗；l复染：番红液复染约2min，水洗；l镜检：革兰氏阳性菌（蓝紫色）；革兰氏阴性 菌（红色）细菌的革兰氏染色实验结果（1）革兰氏阴性菌革兰氏阳性菌细菌的革兰氏染色炭疽杆菌的革兰氏染色 革兰氏染色可见大量细菌 革兰氏染色后在显微镜下观察 细菌的革兰氏染色染色显示革兰氏阳性阴性细菌细菌的革兰氏染色注意事项1. 涂片务求均匀，切忌过厚。 2在染色过程中，不可使染液干涸。 火焰固定 不 宜过热。 3脱色时间十分重要，过长，则脱色过度，会使 阳 性菌被染成阴性菌；脱色不够，则会使阴性菌 被染成阳性菌。 4不能选用老龄菌。细菌的革兰氏染色细菌细胞的生理生化反应相关理论知识（1）l 微生物分类学（microbial taonomy）它是一门按微生物的等级关系把它们安排 成条理清楚的各种分类单元或分类群（taxon）的 科学。它具体的任务是分类（classificontion） 、鉴定（indentification）和命名（ namendature ）。细菌细胞的生理生化反应l微生物的七级分类单位 号（kingdom）（拉：Regnum） 门（Phylum）（拉：Ph