西妥昔单抗抑制MCF-7/TAMR乳腺癌细胞增殖 及下调FUT4和LeY表达作用的研究大连医科大学附属第一医院肿瘤科袁 理 王阿曼 燕 秋 刘基巍研究背景-乳腺癌靶向药物nHER-2为靶点：n赫赛汀(Herceptin)：HER2单抗。n拉帕替尼(Lapatinib)： HER2 与EGFR酪氨酸激酶抑制 剂。nEGFR为靶点：n小分子酪氨酸激酶抑制剂：Gefitinib、ErlotinibnEGFR单克隆抗体：西妥昔单抗(Cetuximab)联合卡铂用 于三阴性乳腺癌患者疗效明显。nVEGF为靶点：n安维汀(Avastin)：VEGF单抗。Carey LACarey LA，RugoRugo HS HS，MarcomMarcom PK PK，et al. J et al. J ClinClin OncolOncol, 2008,26(15): 1009., 2008,26(15): 1009.研究背景-信号转导通路受体酪氨酸激酶(RTKs)与下游信号转导通路nLewis Y寡糖(LeY)：细胞表面寡糖抗原，与肿瘤侵袭转移 及预后密切相关。岩藻糖基转移酶( FUT4)是催化LeY合 成的关键酶。n多种上皮来源肿瘤中60%90%存在LeY高表达，包括乳 腺癌。研究发现抗体封闭LeY可使小鼠胚胎细胞表面 EGFR表达下降。n我们在验证西妥昔单抗抑制MCF-7/TAMR细胞ERK途径过 度激活的同时，检测了细胞中ERK信号传导通路被抑制 前后FUT4和LeY寡糖抗原的表达量，以论证LeY寡糖能否 成为乳腺癌治疗的分子靶点以及诊断和判断指标。研究背景-课题设计Green MD, Francis PA, Gebski V, et al. Ann Oncol. 2009,20(11):1813-1817.Oliveras-Ferraros C, et al. Int J Oncol. 2008,33(6):1165-1176. n细胞系nMCF-7乳腺癌细胞n主要实验方法n MTT比色法检测细胞增殖抑制n七天连续培养并拍照记录细胞数量、形态n RT-PCR检测细胞mRNA合成n Western blot检测细胞蛋白表达n免疫荧光细胞化学法检测细胞蛋白表达材料与方法他莫昔芬诱导野生型MCF-7细胞耐药 形成MCF-7/TAMR细胞株RT-PCR 检测用药后 MCF-7/TAMR 细胞PCNA的 mRNA合成加入西妥昔单抗 7天连续培养 MCF-7/TAMR细胞 并拍照MTT比色法检测不 同浓度西妥昔单 抗对MCF-7/TAMR 细胞增殖的抑制 作用并做统计分析Western blot 检测用药后 MCF-7/TAMR细胞 PCNA蛋白表达Western blot分别检测野生 型MCF-7和MCF-7/TAMR细 胞EGFR和p-EGFR表达情况实验流程-1西妥昔单抗对MCF-7/TAMR细胞增殖的作用RT-PCR检测 用药后 MCF-7/TAMR 细胞中FUT4 mRNA的合成间接免疫荧光 检测用药后 MCF-7/TAMR 细胞EGFR磷酸 化情况Western blot 检测用药后 MCF-7/TAMR 细胞EGFR和 ERK1/2的磷 酸化情况Western blot 检测用药后 MCF-7/TAMR 细胞中FUT4 蛋白表达情况Western blot 检测用药后 MCF-7/TAMR 细胞LeY蛋白 表达情况西妥昔单抗对ERK通路和LeY、FUT4表达的作用间接免疫荧光 检测用药后 MCF-7/TAMR 细胞FUT4蛋 白表达情况间接免疫荧光 检测用药后 MCF-7/TAMR 细胞LeY蛋 白表达情况实验流程-2nMTT显示西妥昔单抗能够抑制乳腺癌MCF-7/TAMR细胞增殖并呈时间 、剂量依赖性。n7天连续 加药培养显示用药组（hn）细胞形态改变，且数量明显少于对照组。实验结果-1( p=0.017 )(A) The different inhibition efficiency of drug concentrations to MCF-7/TAMR cells proliferation was measured by MTT colorimetric assay (*p 0.05). (B) 7 days continuous culture pictures of non and cetuximab treated MCF-7/TAMR cells. 用药组对照组实验结果-2nRT-PCR及Western blot显示西妥昔单抗能够抑制MCF-7/TAMR细胞中细胞核增殖抗原(PCNA) mRNA和PCNA蛋白的合成，具有剂量依赖性。(C) The differences of the PCNA mRNA expression in non and cetuximab treated MCF-7/TAMR cells were detected by RT-PCR. (D) The differences of the PCNA protein expression in non and cetuximab treated MCF-7/TAMR cells were detected by western blot.实验结果-3n使用他莫昔芬剂量1mol/L作用MCF-7细胞持续3个月以诱导形成MCF- 7/TAMR细胞，3个月后Western blot检测显示MCF-7/TAMR细胞中 EGFR表达量显著高于野生型MCF-7细胞。Expression of EGFR and p-EGFR in wild type MCF-7 and MCF-7/TAMR cells were detected by western blot.实验结果-4nWestern blot显示西妥昔单抗组和PD98059组的p-EGFR蛋白含量均明显低于阴性对照组；西妥昔单抗组p-ERK1/2蛋白含量明显低于阴性对照组。间接免疫荧光细胞化学结果显示，西妥昔单抗组(b、e)和PD98059组 (c、f)的p-EGFR荧光强度明显低于阴性对照组(a、d)。（A) The efficiency of cetuximab inhibit EGFR and ERK1/2 phosphorylation in MCF-7/TAMR cells were detected by western blot. (B) Indirect immunofluorescence staining to detect the efficiency of cetuximab inhibit EGFR and intracellular ERK1/2 phosphorylation in MCF-7/TAMR cells.实验结果-5nRT-PCR与Western blot显示西妥昔单抗组和PD98059组FUT4 mRNA及FUT4蛋白合成均少于阴性对照组。西妥昔单抗组(b)和PD98059组中FUT4的荧光强度明显低于阴性对照组。(A) The difference of the FUT4 mRNA expression in MCF- 7/TAMR cells been treated with non and cetuximab and ERK1/2 signaling pathway inhibitor PD98059 were detected by RT-PCR. (B) The differences of the FUT4 protein expression in non and cetuximab and PD98059 treated MCF-7/TAMR cells were detected by western blot. (C) Indirect immunofluorescence staining was used to detect the differences of the FUT4 protein expression in non and cetuximab and PD98059 treated MCF- 7/TAMR cells.实验结果-6nWestern blot显示西妥昔单抗和ERK通路抑制剂PD98059均可使MCF-7/TAMR细胞中LeY抗原表达水平下降。西妥昔单抗处理组(b)和PD98059组(c)LeY荧光强度明显低于阴性对照组(a)。(A) The differences of the LeY expression in non and cetuximab and PD98059 treated MCF- 7/TAMR cells were detected by western block(B) Indirect immunofluorescence staining was used to detect the differences of the LeY protein expression in non and cetuximab and PD98059 treated MCF-7/TAMR cells.n本研究证实他莫昔芬诱导耐药的MCF-7/TAMR细胞中EGFR和激活的p-EGFR表达均增加，表明内分泌治疗与分子靶向治疗存在联系。n西妥昔单抗对MCF-7/TAMR细胞增殖确有抑制作用，通过下调细胞FUT4和LeY实现的，为乳腺癌靶向治疗提供了新的靶点，也为个体化治疗用药顺序和逆转耐药提供了新的思路。结 论-1n西妥昔单抗的抗肿瘤机制：抑制EGFR磷酸化后进一步阻 断MCF-7/TAMR细胞内ERK信号转导通路； ERK途径是调 控MCF-7/TAMR细胞FUT4和LeY合成的主要途径。n以LeY为靶点的靶向药物值得深入研究，并且提示单克隆 抗体和LeY分子靶向药物联合应用可能疗效更佳。结 论-2西妥昔单抗FUT4LeYEGFR磷酸化 ERK途径抑制MCF-7/TAMR细胞增殖