SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（ PAGE）测定蛋白质分子量授课教师：周杰一. 实验目的学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原 理。 掌握垂直板电泳的操作方法。 运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染 色鉴定。二 .实验原理带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动，这 种现象称为电泳。 电泳分类：移动界面电泳、区带电泳、稳态电泳。 区带电泳是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄 层样品溶液，然后加电场，分子在支持介质上或支 持介质中迁移。支持介质的作用主要是为了防止机 械干扰和由于温度变化以及大分子溶液的高密度而 产生的对流。 区带电泳使用不同的支持介质，早期有滤纸、玻璃 珠、淀粉粒、纤维素粉、海砂、海绵、聚氯乙烯树 脂；以后有淀粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜， 现在则多用聚丙烯酰胺（PAGE）和琼脂糖凝胶。二. 实验原理PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系 统和不连续系统两大类，连续系统电泳体 系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗 粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效 应。不连续系统中由于缓冲液离子成分， pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带 电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分 子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离 条带清晰度及分辨率均较前者佳。二. 实验原理 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系 统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）， SDS能断裂分 子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构 ，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白 质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与 SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质 复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白 质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小 为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白 质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的 结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白 质分子的迁移速度取决于分子大小。当分子量在 15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量 的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式 中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数， 若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对 数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同 条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准 曲线上求得分子量。二. 实验原理 SDS电泳的成功关键之一是电泳过程中， 待别是样品制备过程中蛋白质与SDS的结 合程度。影响它们结合的因素主要有三个 ： 溶液中SDS单体的浓度，当单体浓度大于 1mmol/L时大多数蛋白质与SDS结合的 重量比为1:1.4，如果单休浓度降到0.5 mmol/L以下时，两者的结合比仅为1: 0.4这样就不能消除蛋白质原有的电荷差 别，为保证蛋白质与SDS的充分结合，它 们的重量比应该为1:4或1:3 样品缓冲液的离子强度。SDS电泳的样品 缓冲液离子强度较低，通常是10 100mmol/L 二硫键是否完全被还原二. 实验原理采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测蛋白质分子量时， 只有完全打开二硫键， 蛋白质分子才能被解聚，SDS 才能定量地结合到亚基上而给出相对迁移率和分子量 对数的线性关系。因此在用SDS处理样品同时往往用 巯基乙醇处理，巯基乙醇是一种强还原剂，它使被还 原的二硫键不易再氧化，从而使很多不溶性蛋白质溶 解而与SDS定量结合。 有许多蛋白质是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽 链（如胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在SDS和巯基乙 醇作用下，解离成亚基或单条肽链，因此这一类蛋白 质，测定时只是它们的亚基或单条肽链的MW。 已发现有些蛋白质不能用SDS-PAGE测定分子量。如 电荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白 质（某些糖蛋白）以及一些结构蛋白，如胶原蛋白等 。二. 实验原理采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测蛋白质分子量时， 往往采取2种以上测定方法结合使用。目前其他常用测 定相对分子量的方法有： 聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子量 （有浓缩样品特点，可分次加样；不需解离亚基，适 宜测定球蛋白，而对纤维蛋白有误差。电泳需2000伏 特小时） 凝胶层析法测定蛋白质相对分子量（特点方法简单， 样品用量少，而且有时不需纯物质，一般不引起生物 活性物质的变化。局限性是pH6-8的范围内，线性关 系比较好，但在极端pH时，蛋白质有可能因变性而偏 离。）三. 实验试剂和器材1.材料：低分子量标准蛋白试剂盒: 低分子量标准蛋白： 兔磷酸化酶B MW=97,400 牛血清白蛋白 MW=66,200兔肌动蛋白 MW=43,000牛碳酸酐酶 MW=31,000胰蛋白酶抑制剂 MW=20,100鸡蛋清溶菌酶 MW=14,400开封后溶于200l蒸馏水，置-20保存，使用前室温融化， 沸水浴中加热3-5分钟后上样。样品1：称3mg样品1，加2 ml蒸馏水溶解。2.实验试剂(1) 30%丙烯酰胺（Acr）：称Acr30g，甲叉双丙烯酰胺（Bis）0.8g，加蒸馏水至100ml，过滤后置棕色瓶中，4贮存可用1-2月。 （2）10%SDS（十二烷基磺酸钠） （3）1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液：称取Tris18.2g， 加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH8.8， 最后用蒸馏水定容至100ml。 （4）1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液：称取Tris12.1g，加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH6.8， 最后用蒸馏水定容至100ml。 （5）0.05mol/LpH8.0Tris-HCl缓冲液：称取Tris0.6g，加 入50ml水，用1mol/L盐酸调pH8.0，最后用蒸馏水定容至100ml。（7）10%过硫酸铵(AP) （8）TEMED（四甲基乙二胺） （9）样品溶解液：SDS（100mg）+巯基乙醇（0.1ml）+溴酚蓝（2mg）+甘油（2g） +0.05mol/L pH8.0Tris-HCl（2ml），最后定容至10ml。 （10）固定液：取50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混匀。 （11）染色液：称取考马斯亮蓝R250 0.125g，加上述固定液 250ml， 过滤后备用。 （12）脱色液：冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水定容至 1000ml。 （13）电极缓冲液（内含0.1%SDS，0.05mol/LTris- 0.384mol/L甘氨酸缓冲液pH8.3）：称Tris6.0g，甘 氨酸28.8g ，加入SDS1g，加蒸馏水使其溶解后定容至1000ml。2.实验试剂3. 实验器材垂直板电泳装置 直流稳压电源 移液管滤纸 微量注射器 大培养皿各部分凝胶配制四.实验过程1.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干, 准备2个干净的锥形瓶. 2.把玻璃板在灌胶支架上固定好. 固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板 . 3.按比例配好分离胶,用移液管快速加入,大约5厘米左右, 之后加少许蒸馏水,静置40分钟. 凝胶配制过程要迅速, 催化剂TEMED要在注胶前再加入, 否则凝结无法注胶.注胶过程最好一次性完成,避免产生气 泡.四. 实验过程.水封的目的是为了使分离胶上延平直，并排除 气泡凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的 界面. 4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好 浓缩胶,连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处,迅速 插入样梳,静置40分钟.样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底 需水平.四. 实验过程5.拔出样梳后,在上槽内加入缓冲液,没过锯齿时可拆去底端的琼脂糖.要使锯齿孔内的气泡全部排出,否则会影响加样效果. 6、加样三个。 （1）取10l标准蛋白溶解液于EP管内，再 加入10l 2倍样品缓冲液，上样量为20l。（2）取10l样品1溶液，再加入10l 2倍样品缓冲液，上 样量分别为5l 和10l。 7.用微量注射器距槽底三分之一处进样,加样前,样品在 沸水中加热3分钟，去掉亚稳态聚合。注射器不可过低,以防刺破胶体,也不可过高,在样下 沉时会发生扩散.为避免边缘效应,最好选用中部的孔注样.四. 实验过程8.电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒 定在10mA，当进入分离胶后改为20mA，溴酚蓝距凝胶边缘 约5mm时，停止电泳。9.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板 做好标记后放在大培养皿内，加入染色液，染色1小时左右。 10.脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱 色，直到蛋白质区带清晰。剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分. . 11.实验结果分析。五.分析计算绘制标准曲线：按下式计算相对迁移率：以每个蛋白标准的分子量对数对它 的相对迁移率作图得标准曲线，量 出未知蛋白的迁移率即可测出其分 于量，这样的标难曲线只对同一块 凝胶上的样品的分子量测定才具有 可靠性。六.思考题在不连续体系SDS-PAGE中,当分离胶加完后,需 在其上加一层水,为什么? 电极缓冲液中甘氨酸的作用? 在不连续体系SDS-PAGE中,分离胶与浓缩胶中 均含有TEMED和AP,试述其作用? 样品液为何在加样前需在沸水中加热几分钟?