第五章 动植物细胞培养动力学51 动植物细胞培养的特性 动植物细胞培养技术是一项将动植物组织、器官或细胞在 适当的培养基中进行离体培养的技术。 组织是指由结构和功能相似的细胞和细胞间质组成，具有 一定形态和生理功能的聚集体。 器官是指机体中具有特殊结构和完成特殊功能的分化部分 。 组织与器官的培养是指在人工条件下，使它们得以继续生 存或发展的一种培养方法。 根据培养对象的不同，细胞培养分为动物细胞培养与植物 细胞培养两类，下面介绍这两类细胞培养的基本特征。 511 动物细胞培养的特性由于动物细胞体外培养具有明显的表达产物的优点，为传统微生物发酵所无法 取代，因此，生物技术中许多有价值的 生物制品，需要借助于动物细胞培养而 获得，这种需求极大地促进了动物细胞 培养技术的发展。 早在1907年，美国的Harrison在世界上首次将蛙的神经组织在试管内培养成功，建立起动物组织 体外培养的第一块基石。 1950年前后，Enders及其同事发表了第一篇关于在培养细胞中生长病毒的报告，开拓了以动物病 毒为研究对象的新领域。当时人们已知道在细胞 培养物中存在一些有特殊功能的蛋白质，如干扰 素、抗生素、疫苗等，但是由于动物细胞的营养 要求复杂，培养要求严格，长期以来未能利用细 胞培养来进行有经济价值的物质的生产。 作为大规模细胞培养，Copsik等成功地 进行了有关仓鼠肾细胞(BHK)的悬浮培 养。随后，细胞培养的原理与方法日臻 完善。 采用在培养液中添加人工合成的小球状 惰性聚合体载体，大幅度提高了细胞的 产量，并在10 000L发酵罐内成功地进行 深层培养。 随着基因工程技术的发展，人们逐渐认识到有许多基因产物不能在原核细胞内表达，它们需要经过真核细胞所特有的 翻译后修饰，以及正确的切割、折叠后，才能形成与自然 分子一样的功能和抗原性，使得动物细胞一跃成为一种重 要的宿主细胞，用以生成多种生物制品，如病毒疫苗、淋 巴因子(如r干扰素等)、单克隆体、红细胞生成素、纤维蛋 白溶酶原激活剂、第八因子、肿瘤坏死因子、上皮生长因 子和过氧化物歧化酶等。采用大规模细胞培养技术生产贵 重药品在临床诊断、治疗和预防等方面都有重要意义。动物细胞培养与微生物培养对比有许多不 同点(表51)。主要是动物细胞无细胞壁，机械强度低，适应环境能力差；生长 速度缓慢，易受微生物污染，培养时需 要抗生素，且大多数哺乳动物的细胞需 附着在固体或半固体的表面才能生长； 对营养要求严格；大规模培养时，不可 简单地套用微生物培养的经验等。 大规模细胞培养的主要危险之一是微生物污染。设备、培养基、悬浮系统和操作方法等的复杂 性都易引起微生物污染，这是细胞培养都存在 的一个普遍问题，在大规模培养中更为严重。 动物细胞生长十分缓慢，并易被大多数微生物 污染物所破坏。支原体(mycoplasma)对动物细胞培养的威胁最大，因为其感染力强且不易检 出。因此，大规模细胞培养成功的必要条件是 要有一个设备精良的细胞库(cell bank)。在细 胞库中的冷冻细胞不受污染。 由于动物细胞无细胞壁，因此人们一般认 为细胞的脆性是导致培养控制(如溶 氧)复杂化的关键。然而，选择坚韧的细胞 ，就不存在上述问题。经仔细设计的培 养装置可使细胞悬浮液很好混合，在向 培养基内流加基质和输送气体时也不会 损坏细胞。动物细胞培养基的配方十分复杂，并且还需补充血清和蛋白胨。原料的质量控制 和培养基的生产是大规模细胞培养的主 要问题。因为血清来源困难，质量不稳 定，残留血清给产物提纯带来困难等， 所以，常采用无血清培养基。但是，在 无血清培养基中更可能出现细胞毒(与水 中的微量元素或有机污染有关)。 因此，与培养物相接触的水必须采用高纯度的水。高纯度水的腐蚀性很强，并且 有从金属物沥出元素的能力，所以，凡 是与纯水接触的不锈钢容器和管道的表 面都必须进行适当处理。培养基一般需 经膜过滤器过滤。常用的膜过滤器可保 证其无菌状态，甚至支原体也可被0 1um的过滤膜滤出。目前，利用动物细胞培养的方法生产的有 用产品大致可分为4大类：疫苗；干扰素；单克隆抗体；遗传重组产品。总之，动物细胞培养过程的特征是：(1)生长速率慢，易被微生物污染，但可采用在培养基中加入抗生素等措施来解决。(2)细胞个体大且无壁，对环境敏感，因此应慎重 解决供氧(搅拌与通风)与细胞脆弱的矛盾。(3)设备放大是一新课题，不能完全按照微生物反应过程的经验。(4)反应过程成本高，主要用于高附加值产物的生产。51.2 植物细胞培养的特性 有关植物细胞培养的基础研究很多，而工业规模 应用却较少。 早在1902年，出生于奥地利的德国植物学家巳 Haberlandt就预言植物细胞培养的可能性。 1937年前后，法国和美国科学家分别成功地进行了胡萝卜和烟草的组织培养。随后，人们 认识 到生长素等植物激素在组织培养中的作用。 1966年Klein指出，能利用植物细胞培养 物代替栽培植株来生产生化制品。近40 年来，植物细胞培养研究成功的例子已 有不少，如用紫草悬浮培养物生产紫草 宁，烟草细胞的大量培养等。与微生物相比，植物细胞具有这样一些特性(表41)：细胞个大，并且细胞壁是以纤维素为主要成分，耐拉不耐扭，因此，抗剪切能力低。与动物细胞培养类同，生长速率慢，为防止培养过程中染菌，需加抗生素。细胞培养需氧，而培养液黏度大，且不能强力通风搅拌。产物在细胞内且产量低。培养的植物细胞常生长成各种大小的团块(从几个细胞 到几百个细胞)，增加了悬浮培养的难度等。 生长缓慢等是植物细胞的先天不足，然 而它能产生一些微生物所不能合成的特 有代谢产物，如朝鲜参皂角苷、桉树油 和某些生物碱等。 植物细胞培养技术为大规模生产这些有 用物质提供了新途径。细胞培养用于试 管苗生产，如兰花等名贵花卉的培育， 可以不受环境的影响。 利用植物细胞培养技术进行工业化生产，有产品规格好；易达到供需平衡；生产占地少等优点 。进入20世纪90年代以来，伴随着紫杉醇的研究成功并应用于临床，植物细胞培养及其次级 代谢产物的研究进入了新的发展时期，尤其是 诱导子、前体饲喂、两相法培养、质体转化、 毛状根和冠瘿瘤组织培养等新技术和新方法 的发现和发展，更显示了植物细胞培养工程在 制药领域的广阔发展前景。另外，将固定化技术应用于植物细胞培养 中的研究对有效改善植物细胞培养中出 现的不足有一定成效。可以认为，固定 化技术有可能在植物细胞培养中得以应 用。 52 生长模型与培养条件 521 动植物细胞的生长模型微生物的生长是多种环境因子与细胞内复杂的代谢反应的综合结果，生长与环境 因子的关系目前还难以用简单的方程式 来表达。同理，动植物细胞生长是细胞 与影响细胞生长的环境因子相互作用的 综合结果，并且其研究还处于萌芽阶段 。 5211 碳源与生长模型 微生物反应中，细胞的生长速率与限制性 基质间的关系常用Monod方程来描述。 同理，Monod方程也可以用于表达某些 碳源与动植物细胞生长速率间的关系。 例如，在植物细胞培养过程中，多以蔗糖 为碳源，据安田报道，烟草细胞在分批 培养中，细胞的生长速率与蔗糖浓度的 关系可利用Monod方程来表达，此时umax 0023h-1，Ks235g/L。蔗糖为碳源时，植物细胞首先分解蔗糖为葡萄糖和果糖，然后优先利用葡萄糖。 分别以果糖或葡萄糖为碳源分批培养烟 草细胞时，前者有umax0038h-1 ， Ks=025gL，后者为umax=0038h-1， Ks094gL。5212 呼吸与生长模型 由于动植物细胞的培养过程是好氧过程 ，因此，许多科技工作者研究了与细胞 呼吸速率相关的因素。例如，人参细胞 培养中，添加椰子汁后细胞的生长速率 加快，耗氧量比不添加椰子汁时明显增 大。另外，也有报道，Acer PsedoplatanusL细胞培养中，细胞体 内的含氮量与耗氧量有正比关系。一般好氧微生物的比生长速率u与菌体的维持常 数m及氧的比消耗速率Qo2有如下关系：据加藤等所获得的烟草细胞分批培养的结果表明，当氧为细胞生长的限制性因素 时,u与Q02有与(51)式相似的关系。这说明，植物细胞培养中氧的消耗，部分用 于维持代谢，部分用于生长繁殖，所获 得的m009mmol(gh)，Y0061g mmol，与一般微生物的m和Y值相比 ，m很小而Y较大。这可能是植物细胞培养过程中的重要特性。5213 胞内物质与生长模型 微生物培养中，把细胞内RNA含量作为描述其生长速率的指标，且随微生物比生长速率的增 加，RNA含量增大。植物细胞培养中，也有类似的报道。吉田等在进行人参细胞培养中发现 ，在对数生长期，细胞的RNA含量显著增大。培养烟草细胞时，人们详细研究了细胞的比生 长速率与细胞内RNA的关系，发现其与一般微生物相似，可以用一次方程表达，即综上所述，动植物细胞生长动力学的研究 ，在很大程度上是借鉴了微生物反应 动 力学理论。从已有的实例看，又多属于 定性探讨。 522 动植物细胞的培养操作 5221 植物细胞的培养操作植物细胞的培养方式根据植物细胞所处状态的不同，分为悬浮培养法与固定 化 植物细胞培养法，根据操作方式的不同 ，又分为分批式、反复分批式和连续式 培养3种。下面以悬浮培养法(分批、反 复分批和连续培养)为例进行介绍。 (1)分批培养植物细胞的分批培养与微生物的分批培养类同。由于操作简单，从实验室到大型罐广泛应用。 分批培养中，植物细胞的生长曲线一般呈s形，可明显观察出诱导期、对数生长期、减速期 、静止期和衰亡期(死亡期)，但是与细菌和酵母菌的培养相比，即使是生长速率快的烟草细 胞，分批培养时间(一个周期)也要6d以上，这也就是前面所说的植物细胞培养的先天不足 生长缓慢。 表52表示某些植物细胞分批培养中对数 生长期的u与微生物的比较。即使已 知生长较快的烟草细胞的平均世代时间也 要158h(u0.044h-1)，不到酵母比生长速率的l10。因此，有必要开发长期 无菌培养技术。 目前，无论在实验室还是在工厂中，大至 20t罐，广泛采用分批式操作。藤田开 发的二步培养法是分批培养法的一种变形 ，同时使用两个反应器，第一个反应器 主要是为大量培养细胞，第二个反应器 是为增加目的产物的含量。分批培养中 ，在一定范围内增加底物浓度，可增加 目的产物的产量，但浓度过高又会造成 接种细胞的死亡。(2)反复式分批培养若反应器内培养液体积为V，补加量为F( 等于取出量)，则比值FV称为替换率D 。D与连续培养中的稀释率D不同，其与培养液取出至加入完成期间的比生长速 率u有如下关系：(3)连续培养由于连续培养可以保证细胞生长环境长时 间的稳定，因此，在研究细胞的生理或 代谢等方面时，连续培养是一种重要的 培养方法。与微生物的连续培养相同， 对于单罐连续培养系统，与细胞生长相 关的物料衡算式为 ：一般连续培养的细胞产率高于分批培养的 ，但由于植物细胞生长速率慢，维持长 时间的无菌状态是需要解决的基本技术 问题。另外，单罐连续培养法并不能适 应各种反应，因此，有必要开发一些新 的方法。 5222 动物细胞培养方法 动物细胞培养方法有两种类型，一类是非贴壁依赖性细胞的培养，来源于血液、淋巴组织的细 胞，许多肿瘤细胞(包括杂交瘤细胞)和某些转化细胞属于这一类型，其可采用类似微生物培 养的方法进行悬浮培养。另一类是贴壁依赖性 细胞的培养，大多数动物细胞，包括非淋巴组 织的细胞和许多异倍体体系的细胞属于这一类 型，它们需要附着于适量正电荷的固体或半固 体的表面生长。 能够进行悬浮培养的动物细胞是一类能无限繁殖的细胞，这样的细胞又称为确立细胞株。由于 动物细胞对剪切力的敏感，丰富培养基容易形 成过多泡沫，这都增加了反应器操作的难度。 悬浮培养多采用分批式操作方法，其原理与植 物细胞的类同。另外，适用于动物细胞的还有