实验一 培养基的配制与灭菌一 教学要求l通过配制牛肉膏蛋白胨等培养基，掌握配制培 养基的一般方法和步骤。l了解采用的灭菌方法和原理，掌握高压蒸汽灭 菌技术。 二 实验原理1、Media TypeslSolid Media,semi-solid Media, liquid Media .lEnriched Media, Selective Media, Differential Media， combination selective and differential media 2 Sterilization destruction of all forms of microbial life, including endospores. Physical Methods Moist heat Autoclaving Action - protein denaturation. Very effective method of sterilization; at about 15 psi（Ib/in2 ） of pressure (121C 250F), all vegetative cells and their endospores are killed in about 15 min.Dry heatDirect flaming example: Inoculation loop Hot-air sterilization Baking in oven Very effective method of sterilization, but requires temperature of 170C 340 Ffor about 2 hr.Filtrationl Separation of bacteria from suspending liquid.l Removes microbes by passage of a liquid or gas through a screen like material. Most filters consist of diatomaceous earth, cellulose acetate or nitrocellulose.l 0.45 m filters removes most bacteria, l0.20 m more inclusive, viruses need 0.01 m. l Useful for sterilizing liquids (enzymes, vaccines) that are destroyed by heat.三 实验材料与器材l培养基：牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、 葡萄糖、孟加拉红、链霉素、1 mol/L NaOH、 1 mol/L HCl、KNO3 、K2HPO43H2O MgSO47H2O FeSO47H2O.l器材：玻璃器皿、天平、pH试纸、灭菌锅等四 操作步骤称量溶解调pH *（过滤*）分装*加塞*包扎高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌灭菌操作步骤l首先将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量 的水，使水面与三角搁架相平为宜。放回灭菌桶，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤 ，以免防碍蒸汽流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管 口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透 入棉塞。 加盖，并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽 内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使 螺栓松紧一致，勿使漏气。 开启电源加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除 锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让 锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。当锅内压力升 到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实 验用 1.05 kg/ cm2 ，121.3 ，20 min灭菌。灭菌所需时间到后，切断电源，让灭菌锅内温 度自然下降，当压力表的压力降至0时，打开排 气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。如 果压力未降到0时，打开排气阀，就会因锅内压 力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不 平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养 基而发生污染。将取出的灭菌培养基放入 37 温箱培养24 h， 经检查若无杂菌生长，即可待用。五 注意事项l 培养基分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶 口上，以免沾污棉塞而引起污染。l 使用灭菌锅应严格按照操作程序进行。灭菌所需时 间到后，要先切断电源，让灭菌锅内温度自然下降， 当压力表的压力降至0时，才能打开排气阀。 六 思考题l在配制培养基的操作过程要注意哪些问题？l高压蒸汽灭菌时，为什么要先将灭菌锅锅内的冷空气 完全排尽？