第三章 微生物的纯培养和显微技术 A：研究微生物的途径：（群体）n培养物：在微生物学中，在人为规定的条 件下培养，繁殖得到的微生物群体。n纯培养物：只有一种微生物的培养物。（ 利于研究、应用、重复结果）B：利用显微技术进行研究显微技术包括显微标本的制作、观察、测 定、分析及记录等方面的内容。 第一节 微生物的分离和纯培养 n无菌技术n用固体培养基分离纯培养n用液体培养基分离纯培养 n单细胞（单孢子）分离 n选择培养分离 一、无菌技术 n无菌技术：在分离、转接及培养纯培养(物)时防止其被其他微生物污染的技术。 保持无菌的方法 n高压蒸气灭菌n高温干热灭菌n棉塞n超净工作台等 接种操作 二、用固体培养基分离纯培养 n菌落：单个微生物在 适宜的固体培养基表 面或内部生长、繁殖 到一定程度可以形成 肉眼可见的、有一定 形态结构的子细胞生 长群体。n菌苔：当固体培养基 表面众多菌落连成一 片时，便成为菌苔。菌落n菌落或菌苔是对微生物进行分类和鉴定的重要依据。细菌菌落特征剖面图细菌菌落特征正面图菌落培养平板n培养平板（平板）：指熔化的固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛有固体培养基的平皿。 平板分离微生物纯培养技术 n稀释倒平板法 n涂布平板法 n平板划线分离法 n稀释摇管法 1、稀释倒平板法：n无菌水、梯度稀释、50左右的琼脂培养基、灭过菌的培养皿。注意要稀释得当。n分离出单个菌落以后，重复上述操作数次，便可得到纯 培养。Pour plate稀释倒平板法涂布平板法Spread platen无菌水、梯度稀释n涂布平板 稀释倒平板法和涂布平板法平板划线分离法稀释摇管法n用于分离严格厌氧菌。先将一系列盛有无菌琼脂培养基的试管加热使琼脂熔化后冷却并保持在50左右，将待分离的材料用这些试管进行梯度稀释，试管迅速摇动均匀，冷凝后，在琼脂柱表面倾倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合物，将培养基与空气隔开。 三、用液体培养基分离纯培养 n用于细胞大的细菌、原生动物和藻类等的纯化分离。n稀释法：经高度稀释后，同一个稀释度的试管中大多数（95%以上）表现不生长，很可能得到的是纯培养。 四、单细胞（单孢子）分离 n单细胞分离：采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养。n单细胞分离法的难度与细胞或个体的大小成反比。个体较大的可在低倍显微镜下进行，个体较小的则需采用显微操作仪。五、选择培养分离 n当某一种微生物所存在的数量与其他微生物相比非常少时，单采用一般的平板稀释方法几乎是不可能分离到该种微生物的，故需采用选择培养分离法。1、利用选择培养基进行直接分离 n如要分离高温菌，可在高温条件进行培养；要分离某种抗生素抗性菌株，可在加有抗生素的平板上进行分离。 2、富集培养n主要是指利用不同微生物间生命活动特点的不同，制定特定的环境条件，使仅适应于该条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加，人们能够更容易地从自然界中分离到所需的特定微生物。n富集条件：物理、化学和生物等。以从土壤中分离能降解酚类化合物对羟基苯甲酸的微生物的实验为例。六、微生物的保藏技术 n保藏期间微生物不死亡、不污染、不会因发生而丢失重要的生物学性状。n许多国家都设有相应的菌种保藏机构：n中国微生物菌种保藏委员会n美国典型菌种保藏中心n世界菌种保藏联合会等 菌种保藏n菌种保藏：就是根据菌种特性及保藏目的的不同，给微生物菌株以特定的条件，使其存活而得以延续。 n对于生产中使用的菌种保藏培养基， 要求比较丰富的氮源，以防止菌种退 化变质。菌种保藏方法n连续移接n改变条件（干燥、低温、缺氧、缺乏营养等）使菌株的代谢水平降低，乃至完全停止，达到半休眠或完全休眠的状态，而在一定时间内得到保藏，有的可保藏几十年或更长的时间。n在需要时再通过提供适宜的生长条件使保藏物恢复活力。 1、传代培养保藏n是微生物保存的基本方法。n琼脂斜面、半固体琼脂柱和液体培养等。n橡皮塞封口或用石蜡覆盖，并放置低温保存。n4保存。2、冷冻保藏 n代谢作用停止。n细胞体积大者要比小者对低温更敏感，而无细胞壁者则比有细胞壁敏感。其原因是低温会使细胞内水分形成冰晶，从而引起细胞，尤其是细胞膜的损伤。n速冻及快速解冻可减少损伤；还可加一些保护剂，如0.5%左右的甘油或二甲亚砜可透入细胞，并通过降低强烈的脱水作用而保护细胞；n大分子物质因此在采用冷冻法保藏菌种时，一般应加入各种保护剂以提高培养物的存活率。 3、干燥保藏法 n沙土管保存和冷冻真空干燥保藏是最常用的二项微生物干燥保藏技术。 沙土管保存 n一般将菌种接种至斜面，培养至长出大量的孢子后，洗下孢子制备孢子悬浮液，加入无菌沙土试管中，减压干燥，直至将水分抽干，最后用石蜡、橡胶塞等封闭管口，置冰箱保存。此法主要适用于产孢子的微生物，如芽孢杆菌、放线菌等，保藏时间相对较长。 冷冻真空干燥保藏 n是将加有保护剂的细胞样品预先冷冻，使其冻结，然后在真空下通过水的升华作用除去水分。达到干燥的样品可在真空或惰性气体的密闭环境中置低温保存，从而使微生物处于干燥、缺氧及低温的状态，生命活动处于休眠，可以达到长期保藏的目的。n用水升华的方式除去水分，手段比较温和，细胞受损伤的程度相对比较小，存活率及保藏效果均不错，是目前使用最普遍，也是最重要的微生物保藏方法。 第二节 显微镜和显微技术 n显微镜的种类及原理 n显微观察样品的制备 一、显微镜的种类及原理 n普通光学显微镜n暗视野显微镜n相差显微镜n荧光显微镜n透射电子显微镜n扫描电子显微镜n扫描隧道显微镜 普通复式光学显微镜n普通生物显微镜由三部分构成：照明系统：包括光源和聚光器。光学放大系统：由物镜和目镜组成，是显微镜的主体，为了消除球差和色差，目镜和物镜都由复杂的透镜组构成。机械装置：保证光学系统的准确配制，用于固定材料和观察方便。分辨率n重要性能参数。n显微镜物象是否清楚不仅决定于放大倍数，还与显微镜的分辨率（resolution）有关。n分辨率是指显微镜（或人的眼睛距目标25cm处）能分辨物体最小间隔的能力。n分辨率的大小决定于光的波长和镜口角以及介质的折射率。分辨率n肉眼分辨率一般只有0.25mmn光学显微镜分辨率0.18mn电子显微镜可达0.2nmnR=0.5 /sin/2n式中：n=介质折射率；=镜口角（标本对 物镜镜口的张角），sin/2 =镜口率介质质空气水香柏油溴萘萘折射率11.331.5151.66二、显微观察样品的制备 n要根据显微镜和样品的特点来制备。主要讲述光学显微镜的制样。 1、活体观察n压滴法：将菌悬液滴于载玻片上，加盖盖玻片后立即进行显微镜观察。n悬滴法：在盖玻片中央加一小滴菌悬液后反转置于特制的凹载玻片上后进行显微镜观察，为防止液滴蒸发变干，一般还应在盖玻片四周加封凡士林。n菌丝埋片法：将无菌小块玻璃纸铺于平板表面，涂布放线菌或霉菌孢子悬液，经培养，取下玻璃纸置于载玻片上，用显微镜对菌丝的形态进行观察。n插片法： 2、染色观察n固定的目的：n杀死细菌并使菌体粘附于坡片上。n增加细菌对染料的亲和力。n常用的方法有酒精灯火焰加热和化 学固定二种。 细菌染色法死菌正染色负染色：简单染色法鉴别染色法革兰氏染色法抗酸性染色法 芽 孢 染 色 法荚膜染色法等活菌: 用美蓝或TTC（氯化三苯基四氮唑）等作活菌染色姬姆萨染色法染色观察第三节 显微镜下的微生物 n微生物类群包括细胞型和非细胞型两类，这里主要介绍细胞型微生物。 n细菌和古生菌 n真菌 n藻类 n原生动物 一、细菌和古生菌 n细菌的形态和排列n古生菌n原核生物的细胞大小 1、细菌的形态和排列球菌(Coccus)杆菌(Bacillus)螺旋菌(Spirlla)其他形状的细菌球菌(coccus)单球菌 双球菌 四联球菌 八叠球菌 葡萄球菌 链球菌Arrangement of Spherical Bacterial Cellsdiplococci streptococci tetracocci sarcinae staphylococci .单球菌（显微镜下示意图）单球菌(single coccus). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .双球菌（显微镜下示意图）双球菌(double coccus)Micrococcus aerobic, gram-positive, cell arranges mainly in pairs, or irregular clusters. They are often yellow, orange or red in colour上：显微镜效果下：电 镜 照 片四联球菌 (Micrococcus lactis)八叠球菌(Sarcina ureae)八叠球菌（显微镜下示意图）葡萄球菌左：电镜照片 右：显微镜下的金黄色葡萄球菌葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Staphylococcus - facultatively anaerobic, gram- positive, usually form irregular clusters, nonmotile, catalase positive but oxidase negative, ferment glucose anaerobically.staphylococcistaphylococci链球菌链球菌（显微镜下示意图）链球菌（电镜照片）Streptococcus - facultatively anaerobic or microaerophilic, catalase negative, gram-positive, Cell arranges in pairs or chains, usually nonmotile, A few species are anaerobic rather than facultative. 电子显微镜下的结核菌（绿色的就是结核杆菌 ）杆菌动物宿主细胞感染杆菌濒临死亡电镜照片链杆菌链显微镜下的链杆菌螺旋菌（Spirlla)弧菌 (vibrio)螺菌（spirllum）螺旋体 (spirochaeta)Vibrio, Spirillum and Spirochetevibriospirillumspirochete显微镜下的螺旋菌幽门螺旋菌左：显微数码摄像右：结构示意图放线菌的分布与生活方式放线菌一般分布在含量较低；有机物丰富和呈 微生物碱性的土壤中。 107个g左右能看到：北方春季深层黑土地的白丝能闻到：泥土特有的“泥腥味”Chain of conidiosporesAgar surfaceSubstrate myceliumAerial hyphaeVarious types of spore-bearing structures on the streptomyces放线菌的形态结构（模式图）气生菌丝 孢子丝分生孢子基内菌丝固体基质基内菌丝（Substrate mycelium)又称营养菌丝，功能是吸收营养，直径 0.2-1.2um长度100600um，色素可有可无。基内 菌丝放线菌气生菌丝（Aerial mycelium)基内菌丝长到一定时期，长出培养基外，伸向 空间的菌丝，直径11.4um, 长短不一，形状不一， 颜色较深。气生菌丝 孢子丝(Reproductive mycelium)当气生菌丝生长发育到一定阶段，气 生菌丝上分化出的可形成孢子的菌丝。孢子的形状及在气生菌丝上排列的方式 随种而异。Various types of spore-bearing structures on the streptomyces放线菌孢子丝类型直形弯曲丛生成束单轮生 无螺旋开环钩形 原始螺旋形松螺旋