实验一 环境样品总DNA的提取上海交通大学微生物分子生态学与生态基因组学实验室2004 07重要性：n高质量DNA的提取是进行后续实验的基 础 n高质量DNA的提取是保证所进行的研究 能更全面真实反映所研究的环境的微生 物区系组成结构的前提。Isolation of chromosome DNADiscard proteins, Lipids and carbohydratesDNA的提取是传统分子生物学的常规技术：环境样品：n种类繁多、组成复杂、物理化学性质多变 n纯培养的细胞（inoculated bacteria）通常比环境中的原有的细胞 （autochthonous bacteria）更容易裂解(Tsai and Olson 1991a; Tsai, Marie J. Park et al. 1991b; Jacobsen 1995) n没有一种方法能适用于所有的环境样品，每一种样品根据其特 有的理化和生物学特性，都需要优化出一种特有的提取DNA的 方法(Zhou, Bruns et al. 1996)。 本实验室已经建立的方法：nWei, G. F., L. Pan, H. M. Du, J. Y. Chen, and L. P. Zhao. 2004. ERIC- PCR fingerprinting-based community DNA hybridization to pinpoint genome-specific fragments as molecular markers to identify and track populations common to healthy human guts. J. Microbiological Methods. （in press）nGao, P., and L. Zhao. 2002. DNA Extraction from Actived Sludge for Molecular Community Analysis. ACTA ECOLOGICA SINICA 22:2015- 2019.nYong, Z., Z. Zhihua, L. Wu, P. Yingjie, and Z. Liping. Simultaneous Recovery of Bacterial and Fungal Community Total DNA from Agricultural Soils. (preparing)DNA提取效率的鉴定： nDNA的提取效率，也就是环境样品中有多大比例的微 生物的总DNA被提取出来，是提取环境样品DNA的一 个重要指标。n显微镜观察计数DNA提取前后的细菌细胞数在一些研 究中被用来计算DNA回收效率。(Tsai and Olson 1991a) (Zhou, Bruns et al. 1996) n另一类计算DNA提取效率的方法是在提取DNA的时候 加入外源的已知浓度的纯菌或DNA片段。 (Lee, Bollinger et al. 1996) (Mumy and Findlay 2004) 实验材料：Activated sludge form A1-A2-O wastewater treatment system in Shanghai coking factory.样品的保存：n采集的样品最好立即处理，如不能立即处理，可放在 4冰箱中保存，为了尽量保证样品中微生物的原貌 ，保存时间不超过一天。n处理后的样品可以进行总DNA的提取，也可以添加 20%的甘油（终浓度）保存于-70下。样品前处理：取大约30ml污水样品，4， 10000g，离心5min，收集沉淀。加5倍体积的TENP buffer加玻璃珠充分旋涡（5min） 。10000g，5min，4离心，收集沉淀（重复二次，如果离心后的上 清夜颜色较深，则重复这两步，直到上清夜较为澄清）。 加5倍体积的PBS buffer，旋涡，收集沉淀（重复二次）。 加PBS悬浮，分装到 离心管旋涡均匀。DNA提取加入20%甘油， -70保存 TENP and PBSnTENP buffer：50mM Tris，20mM EDTA，100mM NaCl，0.01g/ml PVP，pH10nPBS buffer：8g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na2HPO4，0.24g KH2PO4， 溶于1L水，pH7.4PVP(聚乙烯吡咯烷酮)主要功能：去除腐殖质 (complex humic compounds)(Reviewed by C.L.Roose- Amsaleg, E.Garnier-sillam et al. 2001) 样品前处理：取大约30ml污水样品，4， 10000g，离心5min，收集沉淀。加5倍体积的TENP buffer加玻璃珠充分旋涡（5min） 。10000g，5min，4离心，收集沉淀（重复二次，对于焦化废水活性污泥样品， 如果离心后的上清夜颜色较深，则重复这两步，直到上清夜较为澄清）。 加5倍体积的PBS buffer，旋涡，收集沉淀（重复二次）。 加PBS悬浮，分装到 离心管旋涡均匀。DNA提取加入20%甘油， -70保存 离心收集样品：前处理的样品经离心收集50mg样品。DNA提取步骤：样品加200l Extraction buffer，加2粒玻璃珠，漩涡5min，使样品充分悬浮。 加入200l SDS buffer (2%SDS)，上下颠倒5min，13000g离心10min 。 将上清液转移到一个新的epp管内。加入400l 平衡酚， 颠倒epp管混匀样品， 13000g 离心15min。（如果蛋白很多，重复此步骤一次） 将上清转移到一个新的epp管内。加入200l 苯酚和200l氯仿， 颠倒混匀。13000g 离心15min。将上清转移到一个新的epp管内。加入400l氯仿，颠倒混匀。13000g 离心15min。将上清液转移到一个新的epp管内，加入0.6倍体积异丙醇， 上下颠倒混匀。-20放置1h或过夜进行沉淀。 14000g离心样品20min，倒掉上清液。样品放在冷冻干燥机内， 干燥15-30分钟。溶于10l ddH2O 或TE buffer 中过柱纯化得到的DNA样品可作各种分析或在-20保存。DNA提取步骤：样品加200l Extraction buffer，加2粒玻璃珠，漩涡5min，使样品充分悬浮。 加入200l SDS buffer (2%SDS)，上下颠倒5min，13000g离心10min 。 将上清液转移到一个新的epp管内。加入400l 平衡酚， 颠倒epp管混匀样品， 13000g 离心15min。（如果蛋白很多，重复此步骤一次） 将上清转移到一个新的epp管内。加入200l 苯酚和200l氯仿， 颠倒混匀。13000g 离心15min。将上清转移到一个新的epp管内。加入400l氯仿，颠倒混匀。13000g 离心15min。将上清液转移到一个新的epp管内，加入0.6倍体积异丙醇， 上下颠倒混匀。-20放置1h或过夜进行沉淀。 细胞裂解14000g离心样品20min，倒掉上清液。样品放在冷冻干燥机内， 干燥15-30分钟。溶于10l ddH2O 或TE buffer 中过柱纯化得到的DNA样品可作各种分析或在-20保存。DNA提取步骤：样品加200l Extraction buffer，加2粒玻璃珠，漩涡5min，使样品充分悬浮。 加入200l SDS buffer (2%SDS)，上下颠倒5min，13000g离心10min 。 将上清液转移到一个新的epp管内。加入400l 平衡酚， 颠倒epp管混匀样品， 13000g 离心15min。（如果蛋白很多，重复此步骤一次） 将上清转移到一个新的epp管内。加入200l 苯酚和200l氯仿， 颠倒混匀。13000g 离心15min。将上清转移到一个新的epp管内。加入400l氯仿，颠倒混匀。13000g 离心15min。将上清液转移到一个新的epp管内，加入0.6倍体积异丙醇， 上下颠倒混匀。-20放置1h或过夜进行沉淀。 细胞裂解去除 蛋白和 细胞碎片14000g离心样品20min，倒掉上清液。样品放在冷冻干燥机内， 干燥15-30分钟。溶于10l ddH2O 或TE buffer 中过柱纯化得到的DNA样品可作各种分析或在-20保存。DNA提取步骤：样品加200l Extraction buffer，加2粒玻璃珠，漩涡5min，使样品充分悬浮。 加入200l SDS buffer (2%SDS)，上下颠倒5min，13000g离心10min 。 将上清液转移到一个新的epp管内。加入400l 平衡酚， 颠倒epp管混匀样品， 13000g 离心15min。（如果蛋白很多，重复此步骤一次） 将上清转移到一个新的epp管内。加入200l 苯酚和200l氯仿， 颠倒混匀。13000g 离心15min。将上清转移到一个新的epp管内。加入400l氯仿，颠倒混匀。13000g 离心15min。将上清液转移到一个新的epp管内，加入0.6倍体积异丙醇， 上下颠倒混匀。-20放置1h或过夜进行沉淀。 细胞裂解去除 蛋白和 细胞碎片沉淀DNA14000g离心样品20min，倒掉上清液。样品放在冷冻干燥机内， 干燥15-30分钟。溶于10l ddH2O 或TE buffer 中过柱纯化得到的DNA样品可作各种分析或在-20保存。DNA提取步骤：样品加200l Extraction buffer，加2粒玻璃珠，漩涡5min，使样品充分悬浮。 加入200l SDS buffer (2%SDS)，上下颠倒5min，13000g离心10min 。 将上清液转移到一个新的epp管内。加入400l 平衡酚， 颠倒epp管混匀样品， 13000g 离心15min。（如果蛋白很多，重复此步骤一次） 将上清转移到一个新的epp管内。加入200l 苯酚和200l氯仿， 颠倒混匀。13000g 离心15min。将上清转移到一个新的epp管内。加入400l氯仿，颠倒混匀。13000g 离心15min。将上清液转移到一个新的epp管内，加入0.6倍体积异丙醇， 上下颠倒混匀。-20放置1h或过夜进行沉淀。 细胞裂解去除 蛋白和 细胞碎片沉淀DNA纯化DNA14000g离心样品20min，倒掉上清液。样品放在冷冻干燥机内， 干燥15-30分钟。溶于10l ddH2O 或TE buffer 中过柱纯化得到的DNA样品可作各种分析或在-20保存。DNA提取步骤：样品加200l Extraction buffer，加2粒玻璃珠，漩涡5min，使样品充分悬浮。 加入200l SDS buffer (2%SDS)，上下颠倒5min，13000g离心10min 。 将上清液转移到一个新的epp管内。加入400l 平衡酚， 颠倒epp管混匀样品， 13000g 离心15min。（如果蛋白很多，重复此步骤一次） 将上清转移到一个新的epp管内。加入200l 苯酚和200l氯仿， 颠倒混匀。13000g 离心15min。将上清转移到一个新的epp管内。加入400l氯仿，颠倒混匀。13000g 离心15min。将上清液转移到一个新的epp管内，加入0.6倍体积异丙醇， 上下颠倒混匀。-20放置1h或过夜进行沉淀。 细胞裂解14000g离心样品20min，倒掉上清液。样品放在冷冻干燥机内， 干燥15-30分钟。溶于10l ddH2O 或TE buffer 中过柱纯化得到的DNA样品可作各种分析或在-20保存。Membrane breaks, then releases organelles 细胞裂解（lysis）:裂解细胞：n常用的方法包括化学裂解、酶裂解和机 械裂解。