第十一章、动物组织与胚胎工程第一节、组织工程器官保存培养：维持器官的存活与功能 组织培养：体外培养生成某些组织 组织修复：通过培养组织、移植或原位地 进行坏损组织的修复。修复缺损器官的方法一般有自体移植 、异体移植和组织代用器三种。1、人体组织与器官的基本结构人体组织由细胞及支撑 细胞的细胞外间质构成 extra-cellular matrix)细胞外间质组成包括： collagen, glycoprotein, hyaluronic acid, proteoglycan, elastin, fibronectin, growth factors, cytokines etc.2、组织工程的三要素细胞、支架、信号A、细胞必须能不断进行细胞分裂，且必 须能被调控分化成特定的组织细胞 干细胞：胚胎干细胞、成体干细胞 组织来源细胞 自体或异体Growth factor stimulationB、组织生长支架需求： （1）、生物亲和性 （2）、生物可降解性 （3）、三维内部连通孔隙 （4）、具备支架强度。蛋白质支架 多糖支架 磷酸钙基生物材料 硫酸钙基生物材料C、生长因子 表皮生长因子：是对上皮细胞增殖有很 强促进作用的53个氨基酸残基的多肽。 神经生长因子：为神经细胞特异性分泌 的营养蛋白。 肝细胞生长因子：为728个氨基酸残基单 链组成。 骨形态发生蛋白：能诱导或刺激新骨的 生成。3、技术路线 （1）体外得到工 程化组织、移植 目前主要的方式 （2）细胞与支架 前体混合注射体内 ，原位形成凝胶支 架，提供新组织形 成的空间皮肤修复骨修复4、已取得成就 第一个组织工程产品人工皮肤已于1997年 3月经美国FDA批准上市。 这种产品是器官基因公司培养出的，被称 为“适移植“的活性皮肤，它由新生儿的包 皮细胞培植而成，呈层状结构，与正常人 的皮肤极为相似，能分泌人体皮肤胶原、 生长因子和结构性蛋白，可与病人自身的 皮肤很好地融合，不存在排异作用，就连 病人自身的血管和色素也会逐渐转移到“ 适移植“活性皮肤中去，愈后不留瘢痕。2000年3月10日，Advanced Tissue Sciences公司宣布成功研制出促进心肌 血管形成的产品。该产品应用后14天即 开始形成新的血管。 据悉，用来修复或取代受损的人体软骨 组织的组织工程产品人工软骨也即将上 市。第二节、胚胎工程胚胎工程（embryo engineering）是指 所有对配子和胚胎进行人为地干预，使 其环境因素、发育模式或局部组织功能 ，发生量和质的变化的综合技术。 包括：胚胎移植、胚胎融合、胚胎分割 、胚胎冷冻、胚胎性别鉴定、胚胎细胞 核移植、转基因操作等一、 胚胎移植 （embryo transfer) （一）、概念及应用 胚胎移植（embryo transfer)也称受精 卵移植，是指一头母畜（称为“供体” ）发情排卵并经过配种后，在一定时间 内从其生殖道（输卵管或子宫角）取出 受精卵或胚胎，然后把它们移植到另外 一头与供体同时发情排卵、但未经配种 的母畜（称为“受体”）的输卵管或子 宫角。这个来自供体的胚胎能够在受体 的子宫着床，并继续生长和发育，最后 产下供体的后代。 “借劣质动物之腹怀优秀个体之胎”胚胎移植成功的羊2.胚胎移植的应用范围 在家畜改良方面的应用 在特定品种扩繁上的应用 在动物生物多样性上的应用 其它方面应用：转基因动物、性别控制、体外受精2.1在家畜改良方面的应用 人工授精技术可成几十到几百倍地提高 了优秀种公畜的配种效能。但对优秀母 畜来说，受其产仔数和世代间隔的限制 ，尤其是牛羊等繁殖力较低的畜种更是 如此。 通过超数排卵和胚胎移植技术（ multiple ovulation and embryo transfer: MOET)牛羊的生长性状年遗 传进展可比正常繁殖提高80%和70%；产 奶性状提高33%。2.2在特定品种扩繁上的应用 牛羊等低繁殖力家畜，从引进到形成一个纯 种群体需要7-8个世代，15-20年。而采用 MEOT法，一次就可获得一个纯种群体。 80年代初，美、澳、新从欧洲引进的大型肉 牛品种均采用胚胎移植技术扩繁。 2000年前后，我国的波尔山羊也是采用胚胎 移植进行扩繁的。2.3在动物生物多样性上的应用 在保护动物遗传资源，提高家畜生产性能， 挽救濒临灭绝的野生动物方面，胚胎移植技 术越越来发挥出重要作用。 冷冻能够很好地保存濒临灭绝动物的胚胎或 生殖细胞，但该种动物雌性个体的减少，也 是这种动物的胚胎或生殖细胞无法得到移植 ，科学家开始研究在该种动物的亚种或亲缘 种中试验，并取得一些成功。如斑马胚胎移 植给马，蒙古马胚胎移植给驴，白肢野牛移 植给荷斯坦牛。2.4 其它方面应用 胚胎移植是克隆技术的必须过程 体外受精必须借助胚胎移植实现“试 管婴儿的继续发育 转基因及动物生物反应器的研究也必 须借助胚胎移植（二） 胚胎移植的生理基础及原则 1.胚胎移植的生理学基础 2.胚胎移植的基本原则1.胚胎移植的生理学基础 成年母畜卵巢上存在数千到上万个卵泡，在外 源激素作用下，每个发情期的卵泡发育和排卵 数可达十数个 每个发情周期生殖器官都有一个孕向发育 早期胚胎处于游离状态 胚胎发育不存在免疫问题 胚胎发育到一定阶段会与子宫发生生理和组联 系 胚胎的遗传性不受受体的影响2. 胚胎移植的基本原则 胚胎移植前后所处的环境的同一性 供体和受体在分类学上的相同属性 动物生理上的一致性：受体和供体在发情时间 上的同期性 动物解剖位置上的一致性：空间环境的一致性 胚胎的发育期限：必须处于周期黄体期内 胚胎的质量：胚胎必须是正常的，并在处理过程 中不受不良因素的影响（三）、胚胎移植的技术程序 1.供体和受体的选择 2. 超数排卵处理 3.供体母畜的配种 4.胚胎的收集 5.胚胎的检查 6.胚胎的保存与培养 7.胚胎的移植 8.供体和受体的术后观察1.供体和受体的选择 供体应具有相当高的育种价值 供体生殖机能应处于较高的状态：产后60 天以上，无生殖系统疾病，体质强健 受体应容易购买，繁殖性能好，对地方适 应性强，体型中上等，非优良品种 受体健康状况良好，已进入发情季节 供受体发情时间应接近或一致2. 超数排卵处理 利用促性腺激素处理，使得卵巢中有更多 的卵泡发育，更多的卵被排出，这个过程 就称为超数排卵（superovulation） 意义：让每个供体提供更多的胚胎 处理时间： 牛：预计自然发情时间的前4天，或发 情周期的第16-17天 羊：发情周期的第12-15天，促性腺激 素处理的第二天或第三天，注射PG3.供体母畜的配种 必须用优秀的种公畜进行多次配种，一般 隔8-12小时进行一次配种，直到发情结束 。 配种前应对种公畜的精液进行质量检查。 可优秀种公畜不足时，可考虑首次采用本 交，以后采用人工授精，也可以全部采用 人工授精。4.胚胎的收集 胚胎冲洗液的配制：杜氏磷酸缓冲液PBS，布 林斯特液SOF合成输卵管液 手术法收集胚胎 输卵管冲胚：顺向冲胚、逆向冲胚 子宫角冲胚 非手术法收集胚胎 二路法 三路法 收集到的冲洗液静置，冲洗液分离。 拣胚：将胚胎移至培养液或保存液中 。 胚胎鉴定：根据透明带、胚胎细胞、 发育阶段及细胞在透明带中的比例确 定胚胎级别。5.胚胎的检查6天收集的胚胎（未拣）二细胞至四细胞胚胎 胚胎的降温：使胚胎停止发育，延长 其体外生存时间 体外培养：将胚胎置于体温条件下， 在培养液中，使其继续发育 胚胎冷冻：通过一定的处理程序，将 胚胎降温冷冻后，保存于液氮中6.胚胎的保存冷藏保存法 低于室温，但还达不到冷 冻阶段的温度对胚胎进行 保存即为冷藏保存法，一 般在010左右保存。 由于低温，可以抑制物质 代谢的速度和细胞分裂的 速度，因之可以延长保存 时间 。冷冻法 冷冻法是指196保存胚胎，在进行 超低温冷冻前，必须进行冷冻保护剂处 理。一般说来，在80以上时，细胞 则逐渐失去活力，到130以下，细 胞内的水分呈微细冰晶样或玻璃样结构 ，细胞内所有需要能量的反应停止，细 胞的活动也几乎停止。 最早，小鼠中获得成功。 手术法移植 非手术法移植7.胚胎移植 供体和受体的抗炎处理 健康状况检查 返情状况检查 妊娠检查及妊娠确定8.供体和受体的术后观察及处理胚胎移植产出的犊牛一次移入三枚胚全部成活受体母羊与所生羔羊二、胚胎嵌合 嵌合体（chimera）是指在同一个体中，由于基 因型不同的细胞或组织互相接触，且各自独自并 存的状态 发育早期，如卵裂球甚至受精卵所形成的嵌合体 称为原发性嵌合体，而把在发育的较晚期，如胚 层已经分化，或器官开始形成后，通过组织移植 或嫁接等方法所形成的部分组织或器官的嵌合， 称为次生性嵌合体胚胎嵌合方法 聚合法 第一种可以利用胚胎与胚胎聚合，即使 用发生致密化后的胚胎，用酸性台氏液 （pH2.5）或0.5链霉蛋白酶除去透明 带，充分洗涤后，放入含有5g/ml植 物凝集素A（PHA）的聚合液滴中。让一 个胚胎垂直位于另一胚胎之上，借机械 压力和PHA的作用，更易聚合。若放到 37时，效果更佳，聚合完毕后，洗除 PHA，继续培养，或进行胚胎移植。有 色 鼠 与 白 色 鼠 胚 胎 融 合胚胎嵌合的鉴定 两种：色素分析法和遗传分析法 色素分析法简单、直观，比较实用。一般 选用肤色、毛色差异明显的动物的胚胎作 为供体胚，如用白鼠或黑鼠。幼鼠生下4 5天后，就可以分析其肤色或毛色，怀孕10 天左右的小鼠胎儿，眼睛就有色素沉积。 或者在出生时，检查眼睑色素情况，确定 是否是嵌合体。胚胎嵌合的意义 胚胎嵌合技术可以作为研究分析哺乳动物 发生机制的重要手段，例如研究卵裂球分 化潜力，研究性分化机制与性比，研究X 染色体失活及其作用和研究胚胎细胞基因 表达的机制；也可以对生理功能分析的应 用，例如对免疫功能、遗传病的研究分析 ；还可以培育杂种个体，甚至是种间杂种 ；可以通过制作各种组合的嵌合体，培育 新的毛皮动物；利用种间移植，分析胎儿 和母体的相互关系。三、胚胎分割 、胚胎分割的原理 根据卵裂球具有发育成为一个个体的全能 性的特点，人们就考虑用这种实验技术， 生产同卵双胎或多胎，以加速优良种群的 繁殖。 胚胎的分割在不同时期有不同的分离培养 方法，如卵裂球分离培养法、致密化前各 期胚胎分割法、桑椹胚至囊胚期胚胎分割 法等。同卵双生过程胚胎分割