液相色谱质谱联用的 原理及应用 中心实验室简介 n色谱质谱的在线联用将色谱的分离能力与质谱 的定性功能结合起来，实现对复杂混合物更准 确的定量和定性分析。而且也简化了样品的前 处理过程，使样品分析更简便。n色谱质谱联用包括气相色谱质谱联用(GC-MS) 和液相色谱质谱联用(LC-MS)，液质联用与气 质联用互为补充，分析不同性质的化合物。 液质联用与气质联用的区别: n气质联用仪(GC-MS)是最早商品化的联用仪器 ，适宜分析小分子、易挥发、热稳定、能气化 的化合物；用电子轰击方式（EI）得到的谱图 ，可与标准谱库对比。 n液质联用(LC-MS)主要可解决如下几方面的问 题：不挥发性化合物分析测定；极性化合物的 分析测定；热不稳定化合物的分析测定；大分 子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物等）的 分析测定；没有商品化的谱库可对比查询，只 能自己建库或自己解析谱图。 NeutralNeutral 10101 110102 210103 310104 410105 5Molecular WeightMolecular WeightIonicIonicAnalyte PolarityIonSprayAPCIGC/MS现代有机和生物质谱进展 n在20世纪80及90年代，质谱法经历了两次飞跃。 在此之前，质谱法通常只能测定分子量500Da以 下的小分子化合物。20世纪70年代，出现了场解 吸（FD）离子化技术，能够测定分子量高达 15002000Da的非挥发性化合物，但重复性差。 20世纪80年代初发明了快原子质谱法（FAB-MS ），能够分析分子量达数千的多肽。 n随着生命科学的发展，欲分析的样品更加复杂， 分子量范围也更大，因此，电喷雾离子化质谱法 （ESI-MS）和基质辅助激光解吸离子化质谱法（ MALDI-MS）应运而生。n目前的有机质谱和生物质谱仪，除了GC-MS的EI和 CI源，离子化方式有大气压电离（API）（包括大气 压电喷雾电离ESI、大气压化学电离APCI、大气压 光电离APPI）与基质辅助激光解吸电离。前者常采 用四极杆或离子阱质量分析器，统称API-MS。后者 常用飞行时间作为质量分析器，所构成的仪器称为 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（MALDI- TOF-MS）。API-MS的特点是可以和液相色谱、毛 细管电泳等分离手段联用，扩展了应用范围，包括 药物代谢、临床和法医学、环境分析、食品检验、 组合化学、有机化学的应用等；MALDI-TOF-MS的 特点是对盐和添加物的耐受能力高，且测样速度快 ，操作简单。 质谱原理简介： n质谱分析是先将物质离子化，按离子的质荷比 分离，然后测量各种离子谱峰的强度而实现分 析目的的一种分析方法。以检测器检测到的离 子信号强度为纵坐标，离子质荷比为横坐标所 作的条状图就是我们常见的质谱图。 常见术语:n质荷比: 离子质量(以相对原子量单位计)与它所带电 荷(以电子电量为单位计)的比值,写作m/Z.n峰: 质谱图中的离子信号通常称为离子峰或简称峰.n离子丰度: 检测器检测到的离子信号强度.n基峰: 在质谱图中，指定质荷比范围内强度最大的 离子峰称作基峰.n总离子流图；质量色谱图；准分子离子；碎片离子 ；多电荷离子；同位素离子总离子流图:n在选定的质量范围内，所有离子强度的 总和对时间或扫描次数所作的图,也称 TIC图.质量色谱图n指定某一质量(或质荷比)的离子其强度对时间所 作的图.n利用质量色谱图来确定特征离子，在复杂混合 物分析及痕量分析时是LC/MS测定中最有用的 方式。当样品浓度很低时LC/MS的TIC上往往看 不到峰，此时，根据得到的分子量信息，输入 M+1或M+23等数值，观察提取离子的质量色谱 图，检验直接进样得到的信息是否在LC/MS上 都能反映出来，确定LC条件是否合适，以后进 行MRM等其他扫描方式的测定时可作为参考。1.02.03.04.001020304050607080901001.02.03.04.05.06.00102030405060708090100质量色谱图总离子流图准分子离子:n指与分子存在简单关系的离子，通过它可 以确定分子量.液质中最常见的准分子离子 峰是M+H+ 或M-H- .n在ESI中, 往往生成质量大于分子量的离子 如M+1,M+23,M+39,M+18称准分子离 子,表示为:M+H+,M+Na+等碎片离子：n准分子离子经过一级或多级裂解生成的产 物离子.n碎片峰的数目及其丰度则与分子结构有关, 数目多表示该分子较容易断裂,丰度高的碎 片峰表示该离子较稳定,也表示分子比较容 易断裂生成该离子。Ephedrine, MW = 165多电荷离子：指带有2个或更多电荷的离子,常见于蛋白质或多肽等 离子.有机质谱中,单电荷离子是绝大多数,只有那些 不容易碎裂的基团或分子结构-如共轭体系结构-才会 形成多电荷离子.它的存在说明样品是较稳定的.采用 电喷雾的离子化技术,可产生带很多电荷的离子,最后经计算机自动换算成单质/荷比离子。 同位素离子n由元素的重同位素构成的离子称为同位素离子.n各种元素的同位素,基本上按照其在自然界的 丰度比出现在质谱中,这对于利用质谱确定化 合物及碎片的元素组成有很大方便, 还可利用 稳定同位素合成标记化合物,如:氘等标记化合 物,再用质谱法检出这些化合物,在质谱图外貌 上无变化,只是质量数的位移,从而说明化合物 结构,反应历程等如何看质谱图：n(1)确定分子离子,即确定分子量n氮规则：含偶数个氮原子的分子，其质量数是 偶数，含奇数个氮原子的分子，其质量数是奇 数。与高质量碎片离子有合理的质量差，凡质 量差在38和1013，2125之间均不可能，则 说明是碎片或杂质。(2)确定元素组成，即确定分子式或碎片 化学式n高分辨质谱可以由分子量直接计算出化合物的 元素组成从而推出分子式n低分辨质谱利用元素的同位素丰度，例:(3)峰强度与结构的关系n丰度大反映离子结构稳定n在元素周期表中自上而下，从右至左，杂原子 外层未成键电子越易被电离，容纳正电荷能力 越强，含支链的地方易断，这同有机化学基本 一致，总是在分子最薄弱的地方断裂。n不同类型有机物有不同的裂解方式n相同类型有机物有相同的裂解方式,只是质量 数的差异n需要经验记忆。质谱解析的一般步骤n(适于低分辨小分子谱图,若已经是高分辨质谱 图得到元素组成更好) n(1)核对获得的谱图,扣除本底等因素引起的失 真,考虑操作条件是否适当n(2)综合样品其他知识：例如熔点，沸点，溶解 性等理化性质，样品来源，光谱，波谱数据等 .n(3) 尽可能判断出分子离子。n(4) 假设和排列可能的结构归属：高质量离子 所显示的，在裂解中失去的中性碎片，如M-1 ，M-15，M-18，M-20，M-31意味着失H ，CH3，H2O，HF，OCH3n (5)假设一个分子结构，与已知参考谱图对照 ，或取类似的化合物，并作出它的质谱进行对 比。有机质谱的特点n优点:n(1)定分子量准确，其它技术无法比。n(2)灵敏度高，常规10-710-8g,单离子检测可 达10-12g。n(3)快速，几分甚至几秒。n(4)便于混合物分析，LC/MS，MS/MS对于难 分离的混合物特别有效, 其它技术无法胜任。n(5)多功能，广泛适用于各类化合物。局限性:n(1)异构体，立体化学方面区分能力差。n(2)重复性稍差，要严格控制操作条件。所 以不能象低场NMR，IR等自己动手，须专 人操作。n(3)有离子源产生的记忆效应，污染等问题 。n(4)价格稍显昂贵，操作有点复杂。质谱仪器： n质谱仪由以下几部分组成n n 数据及供电系统n n进样系统 离子源 质量分析器 检测接收器 n n 真空系统 真空系统 n质谱仪的离子源、质量分析器和检测器必须在 高真空状态下工作，以减少本底的干扰，避免 发生不必要的离子-分子反应。所以质谱反应属 于单分子分解反应。利用这个特点，我们用液 质联用的软电离方式可以得到化合物的准分子 离子，从而得到分子量。n由机械真空泵(前极低真空泵)，扩散泵或分子泵 (高真空泵)组成真空机组，抽取离子源和分析器 部分的真空。 n只有在足够高的真空下，离子才能从离子源到 达接收器，真空度不够则灵敏度低。进样系统n把分析样品导入离子源的装置，包括：直接进 样，GC，LC及接口，加热进样，参考物进样 等。离子源n使被分析样品的原子或分子离化为带电粒子(离 子)的装置，并对离子进行加速使其进入分析器 ，根据离子化方式的不同，有机质谱中常用的 有如下几种，其中EI，ESI最常用。nEI(Electron Impact Ionization):电子轰击电离硬电离。 nCI(Chemical Ionization):化学电离核心是质子转移。 nFD(Field Desorption):场解吸目前基本被FAB取代。 nFAB(Fast Atom Bombardment):快原子轰击或者铯离子 (LSIMS,液体二次离子质谱 ) 。 n ESI(Electrospray Ionization):电喷雾电离属最软的电离 方式。适宜极性分子的分析，能分析小分子及大分子(如蛋 白质分子多肽等) n APCI(Atmospheric Pressure Chemical Ionization):大气压 化学电离同上，更适宜做弱极性小分子。 nAPPI(Atmospheric Pressure PhotoSpray Ionization):大气 压光喷雾电离同上，更适宜做非极性分子。 n MALDI(Matrix Assisted Laser Desorption):基体辅助激光 解吸电离。通常用于飞行时间质谱和FT-MS，特别适合蛋 白质，多肽等大分子n其中ESI，APCI，APPI统称大气压电离(API)实验室现有的离子源:nESI电喷雾电离源nAPCI大气压化学电离源电喷雾（ESI）的特点 n通常小分子得到M+H+ +,M+Na+ 或M-H-单电荷 离子，生物大分子产生多电荷离子，由于质谱仪测 定质/荷比，因此质量范围只有几千质量数的质谱 仪可测定质量数十几万的生物大分子。n电喷雾电离是最软的电离技术，通常只产生分子离 子峰，因此可直接测定混合物，并可测定热不稳定 的极性化合物；其易形成多电荷离子的特性可分析 蛋白质和DNA等生物大分子；通过调节离子源电压 控制离子的碎裂（源内CID）测定化合物结构。大气压化学电离（APCI）特点 n大气压化学电离也是软电离技术，只产生单电 荷峰，适合测定质量数小于2000Da的弱极性 的小分子化合物；适应高流量的梯度洗脱/高低 水溶液变化的流动相；通过调节离子源电压控 制离子的碎裂。电喷雾与大气压化学电离的比较n电离机理：电喷雾采用离子蒸发，而APCI电离是 高压放电发生了质子转移而生成MH+或M-H- 离子。n样品流速：APCI源可从0.2到2 mlmin；而电喷 雾源允许流量相对较小,一般为0.2-1 mlmin.n断裂程度；APCI源的探头处于高温，对热不稳定 的化合物就足以使其分解.n灵敏度：通常认为电喷雾有利于分析极性大的小 分子和生物大分子及其它分子量大的化合物，而 APCI更适合于分析极性较小的化合物。n多电荷：APCI源不能生成一系列多电荷离子NanoSpray 离子源n专门设计的 NanoSpray 离子源特别适合于做 微量的生化样品，其流速范围可从 5nLmin 到luLmin。一滴样品就可做数小时的分析。 可在最小的样品消耗量下获得最大灵敏度。灵 敏度可高达fmole。并可直接与微孔HPLC