抗癌新秀多糖的研究进展抗癌新秀多糖的研究进展报告人：李世刚李世刚多糖研究的历史l1855年Claude Bernard鉴定了“肝的 原样物质”是葡萄糖的一种储藏形式。 l1923年M.Heidelberger和T. Oswald 提出细菌的抗原部分是由糖类物质组成 而不是蛋白质。 l1936年Shera实验证实多糖有抗肿瘤作 用。 l1958年Brander报道了酵母细胞壁多糖 (Zymosan)具有抗肿瘤活性。多糖研究的历史l1969年日本学者千原郎首次报道了从 香菇子实体中分离出一种抗肿瘤多糖 (lentinan, LNT)。 l1988年Dwek Rademache和Parekh首 先创立了“糖生物学( glycobiology )” 。 l2003年美国Technology Review 刊文称,在基因组学和蛋白质组学后, 糖 组学(glycomics),有望取得突破性进展 。多糖的概念多糖是一类由10个以上单糖通过糖苷键连接而成的天然高分子多聚物,广泛分布于多种生物体中,尤其是动物细胞膜、植物和微生物细胞壁中, 是构成生命的分子基础之一。糖生物学的概念l研究自然界广泛分布的糖类(糖链和聚糖) 及其结构、生物合成及生物学的一门学科 。它是生物医学各学科中在基础研究、生 物医学和生物技术方面发展较快的一门学 科。 l糖生物学的研究不仅需要糖类的命名、生 物合成、结构、化学合成的基础研究，还 需要分子生物学、蛋白组学、基因组学、 生理学等方面的基础研究。糖组学及在生命科学研究中的意义l糖组被定义为单一生物体中全部聚糖的总称 。l糖组学则是研究糖组结构与功能的科学。l糖组和糖组学是两个不同的概念，糖组是了 解一个生物体在某种情况下所具有的全部聚 糖种类，而糖组学是对聚糖与蛋白质间相互 作用和功能的全面分析研究，包括糖组的结 构鉴定、编码糖蛋白的基因和蛋白质糖基化 的机制和功能等。糖组学及在生命科学研究中的意义l糖分子多以糖蛋白或其它结合物形式存在 于细胞的任何部位，糖与蛋白质问的相互 作用能介导细胞问相互反应的基本过程， 如细胞的增殖、吸附、识别和免疫等功能 。糖组学研究是定义复杂生命系统和细胞 体系必不可少的，如果在糖组概念下，能 够阐明聚糖结构的差异与个体、发育、疾 病等的关联性，就可以定义糖的功能和它 们存在的目的。糖组学及在生命科学研究中的意义l人类基因组序列的破译极大地鼓舞了人们 要迅速阐明基因功能和识别以基因组为基 础的潜在药物靶标的热情，并启动了蛋白 质组学研究，但很快发现以目前的知识水 平根本无法搞清基因表达、蛋白质活性和 细胞功能问的相互关系。事实上，基因产 物在表达水平上与其基因是不同的。糖组学及在生命科学研究中的意义l大量证据已证实人类基因组约有36万 条基因，但人类蛋白质组却可能有100多 万种蛋白，这种差别主要是由蛋白质翻译 后修饰引起的，其中最普通和最多样的翻 译后加工是蛋白质糖基化，大约有一半以 上的天然蛋白都是糖蛋白。糖组学及在生命科学研究中的意义l糖在生物过程中具有其它生物分了所不可 替代的作用，但由于糖的结构多样性目且 不是基因的直接产物，所以，迄今尚没有 阐明糖的生物功能，而有关蛋白质糖基化 的功能及其分析方法也有很多问题尚待解 决，这些都是基因组学和蛋白质组学所无 法实现的。因此糖生物学家在20世纪末 提出了糖组和糖组学概念，并得到科学家 们的广泛认同，在后基因组时代的生命科 学研究中成为新的前沿和热点.糖组学及在生命科学研究中的意义l糖组学是继基因组学和蛋白组学后的新兴 研究领域，它的研究结果直接关系到是否 能够阐明基因功能及细胞功能。这是因为 :第一，所有的生命体都是由细胞组成， 而其表面都被各种形式的聚糖所包被，帮 助我们识别细胞类型和状态。但与蛋白质 不同，单从基因组信息无法预测最终的聚 糖结构，因此，迫切需要开发新的糖组学 研究手段和思路以分析糖组结构和功能。糖组学及在生命科学研究中的意义l第二，就像磷酸化一样，糖基化是所有真 核蛋白质翻译后加工的一种形式，但蛋白 质糖基化远较单一结构形式的磷酸化复杂 得多，因此聚糖研究存在各种技术困难， 蛋白质组学中的大多数方法不适用糖基化 研究。第三，按医学观点聚糖研究非常实 用，细胞表面聚糖是生物体所必需的，可 以避免各种微生物对寄主细胞的感染。色谱柱洗脱，苯酚色谱柱洗脱，苯酚- -硫酸法测硫酸法测 定糖含量，根据结果合并流分定糖含量，根据结果合并流分多 糖 提 取 分 离 与 纯 化 流 程 图原料原料 蛋白多糖蛋白多糖中性酶法、中性酶法、SevagSevag法除蛋白法除蛋白总多糖总多糖多糖流分多糖流分滤液滤液多糖组分多糖组分透析膜透析冷冻干燥冷冻干燥水煎醇沉水煎醇沉多糖的分离纯化多糖的提取l预处理 提取之前用石油醚、乙醚等溶剂 除去脂溶性杂质；用85 乙醇除去单糖 、低聚糖及苷类等干扰性成分。l提取 多糖通常用水作溶剂来提取。还可 利用混合溶剂提取法对植物中不同的多糖 进行分离。根据多糖的溶解性可以用超滤 离心分离法提取多糖。对于蛋白多糖，可 利用加酶提取法提取多糖。多糖的分离纯化l除蛋白 传统上有Sevag法、三氟三氯 乙烷法及三氯乙酸正丁醇法等。另外 ，也可以在多糖的水提液中加入中性蛋 白酶和糜蛋白酶，与有机溶剂结合进行 脱蛋白。除蛋白的效果可以用茚三酮反 应检测，结果呈阴性；同时在200 280nm处测定除蛋白后样品的紫外吸收 曲线来检测效果，除掉蛋白质的多糖溶 液一般在260280 nm的紫外吸收峰会 消失，说明多糖不含有蛋白。多糖的分离纯化l除色素 可以用食品级粉末状活性炭吸 附；也可以用双氧水对色素的有色基团 产生破坏而除去色素；还可以用大孔吸 附树脂柱层析脱去色素，这个方法还可 以使多糖混合组分初步分离。多糖的分离纯化l多糖含量测定 测定还原性多糖的方法 有3，5二硝基水杨酸盐(DNS)比色法 和SomogyiNelson法。另一类测定方 法是利用多糖在强酸性条件下脱水生成 糠醛或其衍生物，然后再与酚类或胺类 化合物缩合，生成有特殊颜色的物质这 一性质进行测定，这类方法有地衣酚 硫酸法、苯酚硫酸法和蒽酮硫酸法 。苯酚硫酸法是用得较多的方法。多糖的分离纯化l多糖的纯化 最常用的纯化多糖的 方法是色谱法，包括离子交换色谱 如DEAE纤维素和凝胶色谱如葡 聚糖凝胶（Sephadex）、琼脂糖 凝胶（Sepharose）。实验中常将 粗多糖经色谱柱洗脱，按洗脱曲线 的不同峰收集不同的组分，从而分 级得到各个均一多糖成分。多糖的分离纯化l纯度鉴定 测定方法有功能团分析、比 旋光度、纸色谱和高效液相色谱 (HPLC)、高压电泳、超滤离心分析法 等，其中色谱法和电泳法较常用，其中 色谱法常用的有柱色谱和HPLC等。电 泳鉴定纯度的方法有聚丙烯酰胺凝胶电 泳、玻璃纤维纸电泳和醋酸纤维膜电泳 等。若为纯品，则在色谱柱中洗脱后得 单一对称峰，电泳后会得单一斑点。多糖的结构分析l相对分子质量测定 常用的方法有凝胶 色谱法、蒸汽压渗透计法、端基法、粘 度法、光散射法、渗透压法和超滤法等 。凝胶色谱法是比较常用的方法，用已 知分子量样品作标准，建立标准曲线， 求得待测多糖的相对分子质量。多糖相 对分子质量只代表相似链长的平均而不 是确切的分子大小。往往用不同的方法 会得到不同的相对分子质量。多糖的结构分析化学分析方法 l酸水解 鉴定多糖的单糖组成常用的方 法。 l甲基化法 阐明单糖的连接方式(键型)、 重复结构中某种单糖的数目、末端糖的 性质及分支点的位置等。 l过碘酸氧化 确定多糖中各种单糖的键 型及其比例。 lSmith降解 阐明多糖中单糖的部分连接 顺序和键型。多糖的结构分析物理分析方法 l紫外光谱法 检测多糖中是否含有蛋白质、核酸、多 肽类。 l红外光谱法 确定吡喃糖的苷键构型及常规观察其他 官能团。 l气相色谱法 分析多糖水解后单糖的组成及比例。 l核磁共振光谱法 主要用于确定多糖结构糖苷键的构 型以及重复结构中单糖的数目。 l质谱法 鉴定各种甲基衍生物的碎片、确定各种单糖 残基的连接位置。电喷雾电离质谱、基质辅助激光解 吸电离飞行时间质谱和快原子轰击质谱还可以测定糖 链的相对分子质量及糖链的一级结构。多糖的结构分析生物学方法 l酶学方法 即利用各种特异性糖苷酶水 解多糖分子得到寡糖片段，再与其他定 性、定量方法联用推测多糖的结构。 l免疫学方法 根据多糖抗原与蛋白质抗 体的特异性，制备对抗未知多糖的抗体 ，来阐明未知多糖的结构。多糖的药理作用免疫调节作用 l是多糖最主要和最重要的生物活性之一。目 前己发现100多种中药多糖具有免疫促进作用 。这些多糖通过对机体的细胞免疫、体液免 疫和对补体系统、细胞因子的影响而产生免 疫调节作用。香菇多糖体内给药能诱生IFN。 柴胡多糖、刺五加多糖、羧甲基茯苓多糖、 平盖灵芝多糖和银耳多糖等都能诱生干扰素 。莪术多糖、三七多糖可诱导巨噬细胞分泌 TNF-a。云芝多糖可提高小鼠腹腔巨噬细胞 中TNF-a基因的表达。多糖的药理作用抗肿瘤活性 l大量的研究表明，中药多糖具有肯定的抗肿瘤作用， 且几乎没有毒性。香菇多糖、裂褶菌多糖、猪苓多糖 、云芝多糖等一批质量稳定、疗效确切、毒性和不良 反应小的多糖类药物已用于临床。香菇多糖除对移植 癌的生长有抑制作用外，对原发性自身癌的生长有强 抑制作用，对化学致癌及病毒致癌也有抑制效果。对 于不能手术或再发性胃癌患者，与氟脲嘧啶并用，可 延长生存期。目前临床上使用的均为从菌类等低等植 物中提取的多糖。近年来，越来越多的具有抗肿瘤作 用的高等植物多糖也被发现，如:苦楝多糖、桔梗多 糖、库拉索芦荟多糖、黄皮树多糖，海枣多糖等。多糖的药理作用降血糖活性l研究表明，一些多糖能够促进胰岛分泌 胰岛素，影响糖代谢酶的活性，抑制糖 异生，而产生降血糖作用。薏苡仁多糖 能显著降低正常小鼠及四氧嘧啶和肾上 腺素所致的高血糖小鼠的血糖。人参多 糖有降血糖作用。香菇胞外多糖可显著 降低链脲菌素诱导的糖尿病大鼠血浆中 的Glc、总胆固醇和二酰甘油水平。多糖的药理作用抗病毒活性 l硫酸葡聚糖、角叉菜胶、肝素、硫酸软骨素 等对艾滋病病毒(HIV)具有抑制作用，这些多 糖大都含有硫酸基。1987年，德国Bayer公 司研制的木聚糖硫酸酯对爱滋病有较好的疗 效。科学家们还进一步发现硫酸化多糖能从 多个环节和步骤干扰HIV对宿主细胞的侵袭， 并对HIV有很高的选择性抑制作用。甘草多糖 对牛艾滋病毒BIV、腺病毒、柯萨奇病毒均有 较明显的抑制作用。中药夏枯草中分离出来 的硫酸化多糖具有显著抗HIV的作用。多糖的药理作用抗衰老活性l由于多糖类化合物可以增强机体的免疫 功能，可作为自由基清除剂，在一定程 度上延缓衰老，防治老年病。如刺五加 多糖可延长果蝇平均寿命11.7-30%；枸 杞多糖可延长家蚕五龄期寿命14%。此 外，具有抗衰老作用的还有香菇、银耳 、黑木耳、猴头菌、波叶大黄、黄芪、 红芪、人参等生药中的多糖。多糖的药理作用防治动脉粥样硬化作用 l研究发现，多种多糖具有抗凝血和降血脂的活性，可 使动脉粥样硬化病程减慢、病变减弱、已形成的病变 停止发展，起到防治动脉粥样硬化的作用。 l(1)降血脂：南瓜多糖可升高正常及糖尿病小鼠的高 密度脂蛋白。茶叶多糖可增强卵磷脂胆固醇酰基转移 酶的活性，有利于胆固醇的清除。枸杞多糖对实验性 高脂血症大鼠的血脂有明显影响，可显著降低血清胆 固醇、甘油三酯含量，而对高密度脂蛋白有升高作用 。 l(2)抗凝血：多种硫酸多糖，如藻酸、昆布多糖、海 带多糖等具有抗凝血作用。这些多糖可通过抑制凝血 蛋白酶原转变为凝血酶，产生抗凝血作用。 l(3)降血压：皮果衣多糖、褐藻多糖具有降压作用。多糖的抗肿瘤作用机理免疫调节作用 l人参多糖能增强吞噬细胞能力，并诱导机体效应细胞 IL-1, IL-2, INF mRNA的表达，增强LAK细胞、NK 细胞和CTL细胞的活性，提高机体抗肿瘤的能力。巴 戟天多糖能促进小鼠体内效应细