免疫细胞化学常用试剂免疫细胞化学常用试剂一、固定剂一、固定剂大多数神经激素、肽类物质为水溶性，在用于免疫细胞化学研究之前，常需固定。但肽类和蛋白质的物理、化学性质不同，因而对不同的固定方法或固定剂的反应也不尽相同。某些固定剂甚至可同时破坏和/或保护同一抗原的不同抗原决定簇。因此，在进行免疫细胞化学研究之前，很有必要了解所要研究的物质（蛋白质或肽类）的化学性质，并根据需要来选择适宜的固定剂（或固定方法）以及改进固定条件。目前，免疫细胞化学研究中常用的固定剂仍为醛类固定剂，其中以甲醛类和戊二醛最为常用。在此，简要介绍几种目前较为常用和推荐的固定剂，以供读者选用。1、4%多聚甲醛多聚甲醛-0.1mol/L 磷酸缓冲液（磷酸缓冲液（pH7.3）多聚甲醛 40g0.1mol/L 磷酸缓冲液至 1000ml配制方法：称取 40g 多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入 500800ml 0.1mol/L 磷酸缓冲液（Phosphate Buffer 以下简称 PB），加热至 60左右，持续搅拌（或磁力搅拌）使粉末完全溶解，通常需滴加少许 1N NaOH 才能使溶液清亮，最后补足 0.1mol/L 的 PB 于 1000ml，充分混匀。该固定剂较适于光镜免疫细胞化学研究，最好是动物经灌注固定取材后，继续浸泡固定 224h。另外，该固定剂较为温和，适于组织标本的较长期保存。2、4%多聚甲醛多聚甲醛-磷酸二氢钠磷酸二氢钠/氢氧化钠氢氧化钠试剂：A 液：多聚甲醛40g蒸馏水 400mlB 液：Na2HPO42H2O16.88g蒸馏水 300mlC 液：NaOH 3.86g蒸馏水 200m配制方法：A 液最好在 500ml 的三角烧瓶中配制（方法同前），至多聚甲醛完全溶解后冷却待用。注意，在溶解多聚甲醛时，要尽量避免吸入气体或溅入眼内。B 液和 C 液配制好后，将 B 液倒入 C 液中，混合后再加入 A 液，以 1n NaOH 或 1N HCl 将 pH 调至 7.27.4，最后，补充蒸馏水至 1000ml 充分混合，4冰箱保存备用。该固定剂适于光镜和电镜免疫细胞化学研究，用于免疫电镜时，最好加入少量新鲜配制的戊二醛，使其终浓度为 0.5%1%。该固定剂较温和，适于组织的长期保存。组织标本于该固定液中，4冰箱保存数月仍可获得满意的染色效果。3、Bouins 液及改良液及改良 Bouins 液液试剂：饱和苦味酸40%甲醛 250ml冰醋酸 50ml配制方法：先将饱苦味酸过滤，加入甲醛（有沉淀者禁用），最后加入冰醋酸，混合后存于 4冰箱中备用。冰醋酸最好在临用前加入。改良 Bouins 液即不加冰醋酸。该固定液为组织学、病理学常用固定剂这一，对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整。但因偏酸（pH 为 33.5），对抗原有一定损害，且组织收缩较明显，故不适于组织标本的长期保存。此外，操作时，应避免吸入或与皮肤接触。4、Zambonis（Stefaninis）液）液试剂：多聚甲醛 20g饱和苦味酸 150mlKarasson-Schwlts PB 至 1000ml配制方法：称取多聚甲醛 20g，加入饱和苦味酸 150ml，加热至 60左右，持续搅拌使充分溶解、过滤、冷却后，加 Karasson-Schwlts PB 至 1000ml 充分混合（Karasson -Schwlts 磷酸缓冲液的配制配制方法见后）。该固定液适于电镜免疫细胞化学，对超微结构的保存较纯甲醛为优，也适于光镜免疫细胞化学研究，为实验室常用固定剂之一。我们在应用中，常采用 2.5%的多聚甲醛和 30%的饱和苦味酸，以增加其对组织的穿透力和固定效果，保存更多的组织抗原。固定时间为 618h。5、PLP 液液PLP 液即过碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛固定液（Periodate-Lysine-paraform-alde-hyde fixative）。试剂：过碘酸钠赖氨酸盐酸盐（或盐酸赖氨酸）：多聚甲醛蒸馏水配制方法：（1）贮存液 A（0.1mol/L 赖氨酸-0.5mol/l Na3PO4，pH7.4）：称取赖氨酸盐酸盐 1.827g 溶于 50ml蒸馏水中，得 0.2mol/L 的赖氨酸盐酸盐溶液，然后加入 Na2HPO4至 0.1mol/L，将 pH 调至 7.4，补足 0.1mol/L 的 PB 至 100ml，使赖氨酸浓度也为 0.1mol/L，4冰箱保存，最好两周内使用。此溶液的渗透浓度为300mOs mmol/L/kg。（2）贮存液 B（8%多聚甲醛溶液）：称 8g 多聚甲醛加入 100ml 蒸馏水中，配成 8%多聚甲醛液（方法见前）。过滤后 4冰箱保存。（3）临用前，以 3 份 A 液与 1 份 B 液混合，再加入结晶过碘酸钠（NaIO4），使 NaIO4终浓度为 2%。由于 AB 两液混合，pH 从约 7.5 降至 6.2，故固定时不需再调 pH 值。固定时间为 618h。该固定剂较适于富含糖类的组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。其机制是借助于过碘酸氧化组织中的糖类形成醛基，通过赖氨酸的双价氨基与醛基结合，从而与糖形成交联。由于组织抗原绝大多数都是由蛋白质和糖两部分构成，抗原决定簇位于蛋白部分，故该固定剂有选择性地使糖类固定，这样既稳定了抗原，又不影响其在组织中的位置关系。Mclean 和 Nakane 等认为，最佳的混合是：含 0.01mol/L 的过碘酸盐、0.075mol/L 的赖氨酸、2%的多聚甲醛及 0.037mol/L 的磷酸缓冲液。6、Karnovskys 液（液（pH7.3）试剂：多聚甲醛 30g25%戊二醛 80ml0.1mol/L PB至 1000ml配制方法：先将多聚甲醛溶于 0.1mol/L PB 中，再加入戊二醛，最后加 0.1mol/L 的 PB 至 1000ml，混匀。该固定剂适于电镜免疫细胞化学，用该固定液在 4短时固定，比在较低浓度的戊二醛中长时间固定能更好地保存组织的抗原性和细微结构。固定时最好先灌注固定，接着浸泡固定 1030min，用缓冲液漂洗后即可树酯包埋或经蔗糖溶液后用于恒冷切片。7、0.4% 对苯醌对苯醌 （Parabenzoquinone）试剂：对苯醌 4.0g0.01mol/L PBS1 000ml配制方法：称取 4.0g 对苯溶于 1000ml 0.01mol/L 的 PBS 即可。对苯醌对抗原具有较好的保护作用，但对超微结构的保存有一定影响，故常与醛类固定剂混合使用。一般要求临用前配制，且避免加热助溶，因加热或放置时间过长，固定液变为棕色至褐色，会使组织标本背景增加，影响观察。此外，对苯醌有剧毒，使用时避免吸入或与皮肤接触。8、PFG 液（液（Parabenzoquinone-Formaldehyde-Glutaraldehyde fixative， PFG）试剂：对苯醌 20g多聚甲醛15g25%戊二醛40ml0.1mol/L 二甲酸钠缓冲液 至 1000ml配制方法：先以 500ml 左右的二甲酸钠缓冲液溶解对苯醌及多聚甲醛，然后加入戊二醛，最后加入二甲酸钠缓冲液至 1000ml 充分混合。对苯醌与戊二醛及甲醛联合应用，即可阻止醛基对抗原的损害，又不影响超微结构的保存，故适于多种类抗原的免疫细胞化学，尤其是免疫电镜的研究。9、碳二亚酰胺、碳二亚酰胺-戊二醛（戊二醛（ECD-G）液）液试剂：0.05mol/L PB500ml0.01mol/L PBS500mlTris14g浓 HCl 少许ECD 10g25%戊二醛3.5ml配制方法：先以约 500ml 的 PB 与相同体积的 PBS 混合，加入 Tris（使其终浓度为 1.4%）溶解，以浓 HCl 调 pH 至 7.0，再将事先称取好的 ECD 和戊二醛加入混合液，振摇后计时，用 pH 计检测，约 23min 时，pH 降至 6.6，再以 1N 的 NaOH 在 4min 内调 pH 至 7.0，此时，将该混合固定液加入盛有细胞（经PBS 漂洗过）的器皿中，在 23固定 7min 后，以 PBS 洗去固定液，即可进一步处理。ECD 即乙基-二甲基氨基丙基碳亚胺盐酸盐1-ethyl-3（3-dimethyl-aminoprpyl）-carboi-imide hydrochloride，简称乙基-CDI，常用于多肽类激素的固定，对酶等蛋白质的固定也有良好效果。ECD 单独应用时，边缘固定效应重，但与戊二醛、Tris 及 PB 联合应用，效果明显改善，细胞质仍可渗透，利用细胞中抗原的定位，超微结构保存较好。目前认为是一种用于培养细胞电镜水平免疫细胞化学研究的很好的固定剂。10、四氧化锇（锇酸、四氧化锇（锇酸 Osmic Acid， OsO4）配制：将洗净装有 OsO4的安瓿中加热后，迅速投入装有溶剂的棕色瓶中，使安瓿遇冷自破。也可用钻石刀在安瓿上划痕，洗净后再放入瓶中，盖好瓶塞，用力撞击安瓿，待其破后加溶剂稀释。为保证充分溶解，应在用前几天配制。（1）2% OsO4水溶解：取 OsO41g 溶于重蒸水中。此液常作为储备液，于冰箱中密封保存。（2）1% OsO4-PB：试剂：A、2.26% NaH2PO42H2O 4.15mlB、2.52% Na2HPO42H2O 8.5mlC、5.4% 葡萄糖 5mlD、OsO4 0.5g配制方法：先分别配好 A、B、C 三种液体，取 A 液 41.5ml 与 B 液 8.5ml 混合，将 pH 调至 7.37.4，取 A-B 混合液 45ml 再与 5ml C 液混合即为 0.12mol/L PBG。（3）1% OsO4/0.1mol/L 二甲胂酸钠缓冲液（pH7.27.4）：试剂：2% OsO4水溶液 10ml0.2mol/L 二甲胂酸钠缓冲液（pH7.27.4） 10ml配制方法：取 2%OsO4储备液 10ml 与等量 0.2mol/L、pH7.27.4 的二甲胂酸钠缓冲液充分混合即可。OsO4是电镜研究所必需的试剂，常用于后固定。尽管 OsO4主要为脂类固定剂，但也可与肽类及蛋白质起作用，形成肽-蛋白质或肽-脂交联。过氧化物酶的反应产物经 OsO4处理后，电子密度增高，适于电镜研究。但由于 OsO4的反应产物对光及电子有较明显的吸收能力，因此在免疫细胞化学染色前常需去除，去锇在光镜水平常用 1%的高锰酸钾，在电镜水平则常用 H2O2来处理。以上介绍了目前免疫细胞化学中常用的一些固定液。关于固定液种类还很多，如 70%90%的酒精、丙酮、醋酸酒精（含 0.1%1%醋酸的 70%90%的酒精等），这些溶液都能促使蛋白质凝固。它们最初只是光学显微镜通用的固定液，但在免疫细胞化学上用其它方法不成功时，也可试用。总之，掌握一个原则，免疫细胞化学中，含重金属的固定液禁用（但 Zenker-Formalin 可进行短时的固定）。目前多数认为，对生物标本较好的固定措施是：用 4的 Karnovskys 液灌注固定 1030min 后，接着在 pH7.3、0.1mol/L 的二甲胂酸钠缓冲液中漂洗过液，这种短时冷固定处理，有助于超微结构和许多肽类抗原的保存。对其它较难保存的抗原可尝试 PFG、PLP 及 Zambonis 液等混合固定液。二、缓冲液二、缓冲液免疫细胞化学中应用的缓冲液种类较多，即使是同种缓冲液，其浓度、pH、离子强度等也常常不同。在此介绍几种最常用的缓冲液的配制。1、0.2mol/L（pH7.4）磷酸盐缓冲液（）磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffer， PB）试剂： NaH2PO42H2ONa2HPO412H2O配制方法