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血 清 蛋 白 的 醋 酸 纤 维 薄 膜 电 泳,生 物 化 学 实 验,一、实验目的,学习醋酸纤维薄膜电泳的操作,了解电泳技术的一般原理,二、实验原理,电泳是指带电质点在电场中向本身所带电荷相反的电极移动的现象。在一定pH条件下,不同的质点由于具有不同的等电点而带不同性质的电荷,因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同,即它们的电泳迁移率不同,因此,可使它们分离 影响电泳迁移率的外界因素:电场强度、溶液的pH值、溶液的离子强度和电渗现象 影响电泳迁移率的内在因素:质点所带净电荷的量、质点的大小和形状 采用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法称为醋酸纤维素薄膜电泳。醋酸纤维素薄膜电泳具有微量、快速、简便、分辨力高,对样品无拖尾和吸附现象等优点 醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维素醋酸酯,将它溶于有机溶剂(如:丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等)后,涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状的结构,厚度约为120 m,有很强的通透性,对分子移动阻力很小,三、实验仪器,1、DYY-8C型常压电泳仪:北京六一仪器厂生产,1套/2组,2.醋酸纤维薄膜(2 cm8cm):2片/人。 3.培养皿:一排桌子(即4组)公用5套,包括平衡、染色各用一套,漂洗用3套。 4.点样器:一个/组。 5.滤纸:公用。 6.玻璃板:一块/组。 7.镊子:一个/组。 8.玻棒:公用。,四、实验试剂,1巴比妥缓冲液(pH8.6,离子强度0.07):巴比妥2.76g,巴比妥钠15.45g,用蒸馏水定容至1000mL。 2染色液:氨基黑10B 0.25g,用甲醇50mL、冰醋酸10mL、水40mL溶解(可重复使用)。 3漂洗液:甲醇或乙醇45mL,冰醋酸5mL,水50mL,混匀。4.人或动物血清:从医院或自制,冰冻保存,现取现用,五、实验过程,浸泡:将28 cm醋酸纤维薄膜迎着光辨别光泽面和无光泽面。将粗糙面朝上置于盛有缓冲液的平皿中,浸泡20min方可用于点样点样:用镊子取出浸透的薄膜,夹在两层粗滤纸内吸干多余的缓冲液,然后平铺在玻璃板上(无光泽面朝上)。在另一载玻片上滴一滴血清,点样器(用盖玻片的一边)在血清上蘸一下(可来回移动一次),再将点样器轻印在加样线上,使血清渗透到薄膜内,形成均匀的直线,五、实验过程,电泳槽的准备:根据电泳槽膜支架的宽度,裁剪尺寸合适的滤纸条。在两个电极槽中,各倒入等体积的电泳缓冲液,在电泳槽的两个膜支架,各放两层滤纸条,使滤纸一端的长边与支架前沿对齐,另一端浸入电泳缓冲液中。当滤纸全部润湿后,用玻璃棒轻轻挤压在膜支架上的滤纸以驱赶气泡,使滤纸的一端能紧贴在膜支架上,即为滤纸桥,五、实验过程,电泳:将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上(点样面朝下),另一端平贴在阳极端支架上。盖上电泳槽盖,使薄膜平衡10 min。通电,调节电压至160 V,电流强度为0.40.6 mA/cm膜宽度,电泳时间约25 min 染色:电泳完毕后将薄膜取下, 放在含氨基黑10B染色液的培养皿中浸泡5 min漂洗:将薄膜从染色液中取出后移置漂洗液中漂洗数次,直至背景蓝色脱尽,条带清晰为止,可得到色带清晰的电泳图谱,六、注意事项,保持薄膜清洁,务必戴上塑料手套,勿用手指接触薄膜表面,以免油污或污物沾上,影响电泳结果。 注意醋酸纤维膜的质量,至少浸泡10分钟,浸泡很久仍有大块白色硬点者须弃之不用。 加样时一定要呈直线、垂直、分布均匀,这样泳动的区带整齐、不歪。以免影响蛋白质区带图谱的完美。 电泳槽两边的缓冲液应保持液面在同一水平面上,槽里的缓冲液要保持清洁。 电泳电压大小,时间长短与缓冲液的离子强度都有一定的关系。一般电流约0.40.6mA/cm,电压110160V,通电时间4060min。电压高,电流大,电泳速度加快,时间可缩短,但薄膜上蒸发严重,因此不能无限增大电流。 使用比色皿时要润洗。 染色的同时也是蛋白质的固定,所以,不要将很多蛋白条重叠在一起。 注意薄膜正负极不要搭反,注意簿膜的正反不要放反。放的时候注意血样不要与滤纸接触了。 通电完毕时,必须切断电源,以防触电事故。,七、实验结果,从左至右分别为血清蛋白、1-球蛋白、 2-球蛋白、-球蛋白、-球蛋白、点样处,04,06,07,09,八、失败图谱分析,拖尾状:点样量过多,被分离的血清蛋白不能分离成5条区带或产生拖尾。 有斑点:点样不均匀,不整齐,导致被分离的区带出现斑点。 边流现象:点样板蘸取血清一边多一边少,导致区带分离不清,出现边流现象。 区带模糊:薄膜过湿,样品扩散迅速,导致样品分离不成区带。 锯齿状:薄膜用滤纸吸水过度(薄膜上出现白斑)或点样过慢,又未及时大桥,导致薄膜过于干燥,使区带成锯齿状。 区带倾斜:薄膜搭载滤纸上的位置歪斜,弯曲,与电流方向不平行,或点样一边多一边少,区带容易泳斜。 显色过浅:点样太少,区带显色不明显。 区带重叠:染色时,醋酸纤维薄膜不是一张一张放入染色液的,在染色固定前,薄膜与薄膜之间重叠,造成薄膜上还未固定的血清蛋白彼此粘连。 区带过密:电泳时电压,电流或电泳过小或时间不够,造成区带未分离。,实验结果既有清晰的图谱,也有模糊不清的图谱,九、实验思考,1、为什么要将点样一端放在电泳槽的负极?答:带电质点在电场中向本身所带电荷相反的电极移动。因为血清样品带负电荷,在电场中将向正极泳动,所以点样端要置于负极。2、电泳时电压表显示的电压是否等于加在膜条两端的实际电压,为什么?答:不相等。因为在实际中缓冲液两边离子不平衡。,九、实验思考,3、根据人血清中蛋白各组分的等电点,估计它们在pH8.6的巴比妥电极缓冲液中电泳移动的相对位置。答:,巴比妥电极缓冲液的pH为8.6,蛋白的等电点均低于它,因此蛋白带负电荷,向正极移动。速度为血清蛋白1-球蛋白 2-球蛋白-球蛋白-球蛋白。因此,在电泳图谱上位置由左向右依次为血清蛋白、1-球蛋白、 2-球蛋白、-球蛋白、-球蛋白。,
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