临床标本的细菌学检验,新乡医学院第一附属医院检验科 周艳君,血液标本的细菌学检验,目的要求 1.掌握血液标本的细菌学检验程序、方法和注意事项。 2.掌握血液标本中常见细菌的检验技术。,器材和试剂,1. 标本 疑为菌血症患者的血液标本。 2. 培养基 硫酸镁葡萄糖肉汤、胆汁葡萄糖肉汤、 硫乙醇酸钠肉汤、羊血琼脂平板、巧克力琼脂平板、厌氧血琼脂平板、 KIA、MIU、甘露醇发酵管等。 3. 试剂 3过氧化氢、氧化酶试剂、革兰染色液、 5g片新生霉素药敏纸片等。 4. 其他 沙门菌属诊断血清、新鲜人或兔血浆。,步骤和方法,1. 标本采集(1)采集原则怀疑为菌血症的患者在发病初期或体温上升期采集；原则上应在抗生素使用前采集，对已开始抗生素治疗的患者可在下次给药前采集。(2)皮肤消毒：三步消毒法（70%酒精、碘酒、70%酒精）(3)采血部位：大多肘静脉采集，亚急性细菌性心内膜炎患者股动脉采集。(4)采血量：成人1020ml次，儿童35ml次。血液与培养基比例应为1：5-1:10。(5)血培养次数及采血时间24h内小于3次培养，在抗生素治疗或改变前1-2h采集。急性脑膜炎、骨髓炎、关节炎、细菌性肺炎和肾盂肾炎发热患者，不同部位2次培养；急性心内膜炎患者不同部位3次培养；亚急性心内膜 炎患者24h内隔1续3采血培养，24-48h全部阴性者再采集2-3次培养。菌血症患者血液中病原菌具有周期性出现和浓度水平低两个特点，要求临床多次采集标本进行肉汤增菌培养。,2.检验 程序,3. 常见致病菌检验及报告方式(1) 将血液细菌培养瓶置35孵育箱中孵育，每日 观察1次，连续观察至第7天。注意血液细菌培养瓶的变化。(2) 如怀疑血液细菌培养瓶中有细菌生长，无菌技 术取瓶内液体进行涂片，革兰染色检查，发现细菌，根据细菌的染色性及形态特征发出初步报告（电话通知医生）。(3) 根据涂片结果选择相应抗菌药物，直接从血培 养瓶抽取适量液体做初步药敏试验，于1824h后报告初步药敏结果（电话通知，报告敏感抗 生素。）。,(4) 如有发现培养液混浊、溶血、绿色色素、表面菌 膜生长、胶冻状凝固或细胞层颗粒状生长，均为细菌生长现象。用无菌技术取瓶内液体接种固体培养基。需氧培养瓶接种羊血琼脂平板、巧克力血琼脂平板，前者做普通需氧培养，后者放入到 5CO2 环境35孵育24h，同时接种真菌培养基进行真菌培养；厌氧培养瓶接种厌氧血琼脂平板和羊血琼脂平板，前者置厌氧环境进行3548h厌氧培养，后者做普通需氧培养。观察菌落生长情况。,(5) 对细菌菌落涂片、革兰染色，观察细菌形态及染 色性。如为革兰阴性杆菌，进行氧化酶试验并接种KIA培养基，氧化酶阴性并发酵葡萄糖，初步判断为肠杆菌科细菌；KIA、 MIU培养基上的生化 结果符合沙门菌属者，用沙门菌属诊断血清做玻 片凝集后确认血清型；KIA、MIU培养基上的生化结果符合肠杆菌科其他菌属，血液中常见革兰阴性杆菌的初步鉴定见表5-1-1，全面鉴定参见第二章第二节进行鉴定；氧化酶试验阳性或阴性，不发酵或不利用葡萄糖者，疑为非发酵菌，参见第 二章第三节进行鉴定。,(6)对细菌菌落涂片、革兰染色，如为革兰阳性球菌，葡萄串样或散在排列，触酶试验阳性，初步判断为葡萄球菌属；触酶试验阴性，链状、散在或成双排列，初步判断为链球菌属或肠球菌属。参见第二章第一节进行鉴定。,7.报告方式：在增菌过程中培养瓶中怀疑有细菌生长，经涂片、革兰染色证实，可报告“疑有细菌生长”；经分离培养、生化试验及血清学鉴定后，可报告“血液细菌培养天，有细菌生长”，并同时报告体外抗菌药物敏感试验结果；如果增菌培养至7天，培养瓶中仍无细菌生长迹象，经盲目传代证实无细菌生长，可报告“血液细菌培养7天，无细菌生长”。 8.血液标本常见的病原菌见表5-1-2。教材第149页。,注意事项,一般应在抗菌药物使用前采集血液标本，如果患者已用过抗菌药物或情况不明时，使用硫酸镁肉汤增菌液，以中和四环素、链霉素、新霉素、多粘菌素等抗生素，并添加抗菌物质拮抗剂如5对氨基苯甲酸(PABA)拮抗磺胺类、100IU50ml青霉素酶破坏青霉素和加入0.030.05聚茴香脑磺酸钠(SPS) 。 （SPS既是一种抗凝剂，又可抑制血清中杀菌物质和吞噬细胞、灭活补体、中和溶菌酶及灭活氨基糖苷类和多肽类抗生素， SPS本身可抑制脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌生长。）,2. 对疑为波浪热、亚急性细菌性心内膜炎的患者，培养瓶应孵育至第四周，盲目翻种后无菌生长，方可报告阴性。 3. 为了尽快发现病原菌，在7天的孵育期内应至少盲目翻种2次，第一次在标本孵育1218h后。在以后的孵育期中应每天观察瓶内的变化，如有细菌生长现象，需及时接种和涂片染色观察报告。7天孵育后仍无细菌生长迹象，进行盲目接种。每次接种需氧培养均需接种羊血平板和巧克力琼脂平板；厌氧培养接种厌氧血琼脂平板和羊血琼脂平板，分别进行需氧和厌氧培养。革兰染色提示真菌生长，应接种至沙氏平板，L型菌需转种高渗平板。,4.血液细菌学培养是诊断菌血症和败血症的病原学依据。在同一患者的2份血液标本中检出同一细菌；或检出细菌的患者23周后血清中的相应抗体升高则可作出肯定的病原学结论。 5.一般菌血症由一种细菌引起，但也有同时两种细菌的混合感染、两种细菌或细菌和真菌的先后交替感染情况，有时也会出现不常见的细菌，这些情况不能随意判定为污染菌。约5- 10的菌血症患者是多菌性菌血症，故次代培养时应提供适用于肠道菌、非发酵菌、需氧菌、厌氧菌、苛氧菌和真菌等生长的培养基以及相应的培养条件，以免漏诊。,6.接种标本，分别注入硫酸镁葡萄糖肉汤(需氧培养)和硫乙醇酸钠肉汤(厌氧培养)培养瓶中。疑为沙门菌引起的肠热症可注入胆汁葡萄糖肉汤，轻轻摇动混匀。血液中的抗菌物质如原有抗生素、溶菌酶、抗体和补体等被充分稀释，不能发挥抗菌活性。 7.自动化培养严格按照仪器操作说明执行。 8.无菌操作 (采集、接种、转运、培养、转种、鉴定。),痰液标本的细菌检验,目的要求 1. 掌握下呼吸道标本的细菌学检验程序和方法。 2. 熟悉呼吸道标本的采集方法。,器材和试剂,1. 标本 痰液标本、咽喉拭子。 2. 培养基 血琼脂平板、巧克力琼脂平板、其他常 用生化反应管等。 3.试剂 氧化酶试剂、3过氧化氢、革兰染色液、无菌生理盐水等。 4.其他 二氧化碳孵箱。,步骤和方法,1. 标本采集 (1) 鼻咽拭子 鼻咽拭子是将金属棉拭子的前端弯曲，高压灭菌后备用。采集时，患者先用清水漱口，对光而坐，头向上仰张大口，用压舌板轻压舌跟，取鼻咽拭子绕过悬雍垂，在鼻咽腔、悬雍垂后侧反复涂抹数次小心取出，避免接触口咽部其他组织。,(2) 咽拭子将拭子用无菌生理盐水湿润，用压舌板轻压舌 根，暴露整个口咽部。先用拭子轻擦扁桃体表面后弃去，再取1支湿润的拭子轻压扁桃体，擦取挤压出的分泌物或伪膜等病变部位。,(3) 痰液标本A. 自然咳痰法：嘱受检者用清水漱口数次后，用力咳嗽自气管深部将痰液咳出吐至无菌容器中。对于痰 量少或无痰等咳痰困难者，可雾化吸人45左右的 10氯化钠水溶液，使痰液容易排出。对于幼儿， 可轻轻压迫胸骨上部的气管，使其咳嗽而取之。B. 气管镜采集法：用气管镜在肺内病灶处直接吸取标本或用气管刷采取标本。C. 气管或环甲膜穿刺法：主要用于厌氧菌培养。,2. 检验程序,3.常见致病菌检验及报告方式 3-1.痰液标本的检验 (1)肉眼观察：选取脓血性的痰液用于细菌学检验。异常恶臭的脓性痰常见于肺脓疡患者，可能与厌氧菌有关；痰液中有颗粒状、菌块和干酪样物质可能与放线菌病和曲霉菌感染有关。 (2)涂片检查：挑选痰液中脓、血性部分涂片，干燥固定后，进行革兰染色镜检。如发现形态典型、有特殊结构，初步可以确定所属菌属或种的细菌，可直接报告。如查见革兰阳性葡萄状排列的球菌，可报告“痰液涂片查见革兰阳性球菌，形似葡萄球菌”；查见革兰阳性双球菌、矛头状，有明显荚膜时，可报告“痰液涂片查见革兰阳性双球菌，形似肺炎链球菌”。如果不能直接确定菌属或种的细菌，可报告“痰液涂片查见革兰性菌”。目的有二：1、确定标本是否适合做细菌培养（低倍视野中10个鳞状上皮细胞和25个白细胞为合格标本）。2、初步判定是否有病原菌存在。,(3)涂片检查抗酸杆菌（P163-164页）A.直接涂片B.集菌涂片：离心沉淀集菌法、漂浮集菌法。 (4)分离培养A.标本前处理：均质化法、洗涤法。B.接种标本、分离培养：血平板和麦康凯平板：普通环境下35孵育18-24h。巧克力平板：5%-10%CO2环境下35孵育18-24h。沙氏培养基：必要时用以分离真菌。普通环境下25-30孵育24-48h。 根据菌落形态、细菌涂片染色观察，选择相应生化反应、血 清学试验及药敏试验进一步鉴定，报告“检出XX菌”。 具体检验见相关章节。 18-24h后无可疑致病菌生长者，继续培养至48h，仍无致病菌 生长，则报告“正常菌群”。,(5)特殊细菌培养结核分枝杆菌：参见第二章第六节。嗜肺军团菌：P164页。 3-2.呼吸道标本中常见的正常菌群及病原菌 见表5-5-1教材第164页。,注意事项,1.总原则：避免污染，及时送检(2h内),立即接种,防止干燥。 2.鼻咽拭子检查脑膜炎奈瑟菌通常用于带菌者的检查，采集的标本要保温35 ，防止干燥；最好床边接种，必要时使用卵黄双抗运送液。 3.痰液标本最好采取晨痰，标本量1ml。 4.容器要求：无菌、清洁、干燥、不渗漏、不吸水、广口带盖。 5.对可疑烈性呼吸道传染病（如SARS、炭疽肺、肺鼠疫）的患者采集检验标本时必须注意生物安全防护。,6.上呼吸道有大量的正常菌群存在，正常情况下这些细菌并不致病，但在机体抵抗力下降或某些外在因素作用下，可以侵入下呼吸道致病。因此要正确评价这些菌群的致病作用并不容易，特别是在抗生素作用下或在大量正常菌群掩盖下，致病菌难以检出。因此必须熟练掌握各菌群的特点和数量的关系。报告的各细菌可注明各自所占的比例情况，一般以平板上所有生长菌落所占相对比例来推断，可分为纯培养、大量、中等量、少量和个别。未检出致病菌时，应报告“正常菌群”。 7.白喉棒状杆菌引起的白喉是法定报告的传染病，越早诊断对治疗越有利，同时对防止扩散有重要作用。因此需迅速而准确的检验。,尿液标本的细菌学检验,目的要求 1掌握尿液标本的细菌学检验程序、方法和 注意事项。 2掌握尿液标本的细菌计数方法。,器材和试剂,1.标本 临床尿液标本。 2.培养基 羊血琼脂平板、巧克力琼脂平板、KIA、 MIU、甘露醇发酵管。 3.试剂 3过氧化氢、氧化酶试剂、革兰染色液、抗酸染色液、5g片新生霉素药敏纸片、 NIT及TTC实验用试剂等。 4.其他 诊断血清、新鲜人或兔血浆等。,步骤和方法,1.标本采集正常人的尿液是无菌的，但在尿道口及外阴部位存在正常菌群，在采集尿液标本时，极易引起污染。应遵守无菌操作，避免正常菌群的污染。标本采集方法有五种: (1)中段尿采集法：是临床上最常采用的方法。女性患者先以肥皂水清洗，而后用1：1000的高锰酸钾水溶液冲洗外阴部及尿道口，用灭菌纱布擦干，用手指将阴唇分开排尿，弃去前段尿，留取中段尿1020ml于无菌容器中加盖送检。男性患者应翻转包皮，用1:1000新洁尔灭消毒尿道口，用无菌生理盐水冲洗，无菌纱布擦干后开始排尿，弃去前段尿，留取中段尿1020ml于无菌容器中加盖送检。,(2)导尿法：用导尿管导尿收集1020ml尿液。可以避免 污染，但患者难以接受，而且有诱发逆行感染的危险。 (3)肾盂尿收集法：由泌尿科医师在膀胱镜下分别采集左右侧输尿管的尿液。 (4)膀胱穿刺法：在膀胱充盈的状态下，在患者耻骨联合上用碘酒、酒精消毒后，以无菌注射器穿刺 抽取尿液。此法用于尿液厌氧菌培养或儿童留取中段尿困难者。 (5)留尿法：留取24小时尿液，取沉淀部分约100ml送检。主要用于疑为泌尿道结核患者的检查。,