朔州职业技术学院2012 届毕业论文第 1 页 共 6 页引言在妊娠期预先选择后代的性别， 即性别控制，是一项新的值得探索的生物繁殖技术，它具有巨大的潜在利用价值。人类性别控制重要的应用是减少性连锁遗传病的发生，即可以帮助具有性连锁隐性遗传病的双亲选择生女儿的机会，以避免该病的发生。也可以用于平衡家庭的性比，使家庭人口数减少，以非强制性的方式控制人口的增长，从而改善由于人口过剩造成的社会问题。性别控制技术在家畜生产中的应用潜力更为明显。奶牛场主可利用性别控制技术繁殖更多的是优质母牛。公牛的生长速度要你母牛快，而且阉公牛肉的价格比较高，生产肉牛的农场主借助该技术可繁殖更多的公牛。此外，这一技术还可用于挽救濒临灭绝的珍稀动物。动物性别控制的途径有两种， 一是通过受精后胚胎性别的鉴定而获得所需性别的后代。二是受精前通过体外分离精子而预先决定后代的性别，而后者是动物性别控制最有效的途径。1 研究历史Lush（1925）是最早用分离精子的方法对出生前性别控制进行科学研究的科学家之一。从 20 世纪 2080年代，几乎所有分离精子的研究都是通过“物理分离”方法进行的，即都是以 X和 Y精子之间存在的物理差异为依据进行分离精子的研究，但是这些方法不能将 X和 Y精子之间的可观察到的真正微小差异区分开来。20世纪 60年代流动细胞仪的问世激发了人们测定单个细胞的DNA 进行多种研究的兴趣，尤其是在癌症的诊断方面。1976 年，Gledhill等首先报道使用流动细胞仪测定精子的 DNA ，用以确定由于遗传损伤而可能发生的改变。1979年，Moruzzi 的研究把人的注意力转到了将 DNA 作为性别选择的一种潜在标志， 在他发表的资料中显示了通过测定多种动物染色体的长度来确定X和 Y精子的 DNA 含量的差异。 1983 年，Gamer等利用一个更为简单的非分离流动细胞仪测定家畜精子的细胞核，证实 X和 Y精子 DNA 含量的差异。几十年来人们所获得的关于分离X和 Y精子的知识，使人们在该领域的研究中取得进展，即成功地显示了DNA 是分离有活性的X和 Y精子的有效标记，为最终利用改良的朔州职业技术学院2012 届毕业论文第 2 页 共 6 页流动细胞检索分离仪分离X和 Y精子打下了基础。1989年 Johnson等首先报道用流动细胞检索分离仪成功地分离了兔子活的X和 Y精子， 用分离的精子受精后产下了活的后代，使流动细胞检索分离仪分离精子技术的研究取得了突破性的进展，此后，利用该技术分离有活性的 X和 Y精子已经成功地应用于人工授精、体外受精及胞质内单精子显微注射等的研究，并在家畜猪、牛、羊以及人相继获得成功, 产下了后代。流动细胞检索分离仪分离精子的方法也在不断地改进，速度不断的提高，目前分离速度与90年代相比已提高了近 30 倍。因此，根据 X和 Y精子 DNA 含量存在差异的原理，通过荧光染料与DNA 结合，利用改良的流动细胞检索分离仪进行X和 Y精子的分离方法，是目前最有重要性、科学性和有效性的分离精子的方法。2 X 和 Y精子分离的基础对于不如动物，每一个体携带X和 Y染色体的精子，无论是X或是 Y其含量是恒定的。精子的性染色体DNA 含量是唯一有效的或可检测到的X与 Y精子之间的差异。根据研究显示，所有哺乳动物的X染色体比 Y染色体要大，因而携带更多的DNA 。例如，人的 X染色体的 DNA 含量大约比 Y染色体的多 2.8%3.0% 。 其它哺乳动物的 X和 Y精子 DNA含量的差异比人的稍大一些，差异最大的是爬行田鼠，其X 精子的含量大于Y 精子9.2%12.5% 。因此， X 和 Y精子之间的 DNA含量的差异正是流动细胞检索分离仪进行X和 Y精子分离的理论基础。3根据 DNA含量分离 X和 Y精子的原理在 1997 年以前，大多数哺乳动物X 和 Y 精子的分离是通过标准的流动细胞检索分离仪进行的。其原理是：将细胞膜渗透的精子与荧光染料Hoechst33342 共同培养，该染料则定量地结合到DNA的 AT富含区域。由于携带X染色体的精子比携带Y 染色体的精子含更多的 DNA ，因此当精子通过检索分离仪被定位时，染料经激光照射而释放出强度不同的荧光信号。 信号通过仪器和计算机系统被扩增和分析并做出可能为携带X染色体的精子和携带 Y染色体的精子或检测系统分辨不清的精子的判断。最近研制出的高速流动细胞检索分离仪，在原有的基础上又进行了改进，使包含有精子的液滴产率提高，也使不同精子间产生更大的差异。另外在喷嘴的设计上，检索系朔州职业技术学院2012 届毕业论文第 3 页 共 6 页统更接近喷嘴处（含有被定位的精子）以使被定位的精子达到更高的比例，同时，新的喷嘴设计每小时分离1100万个 X精子，纯度仍可达到 85%90%。 目前该技术已经被动物和人精子的分离系统所采用。4精子分离的精确性与有效性评价精子分离的精确性及有效性的评价可通过两方面来进行：一是通过实验室分析分离的纯度，二是通过产出后代的性比进行鉴定。实验室分析包括：精子样品的重分析、精子PCR和荧光原位杂交（ FISH） 。精子的样品重分析是指用流动细胞检索分离仪重新分析已分离的精子样品，与PCR法和 FISH法相比，它更为简单快速。但对于人的精子来说，用FISH 法分析要优于重分析法，因为人的 X和 Y精子的 DNA 差异仅为 2.8%，重分析法不能一直保持达到所需要的精确性。通过实验室方法对分离程度的鉴定，可看到流动细胞检索分离仪分离精子的纯度保持在90% 左右。通过铲除后代的性别比例的检测时对精子分离效率最为精确的评价。目前已有兔、猪、 牛及人产仔或出生资料的发表。 第一个由分离的 X和 Y精子决定性别产出的后代是来自于兔子的宫内受精实验，其中用X精子受精产下的仔兔中94% 是母兔，由 Y精子受精产下的后代 81% 是公兔。猪也采用同样的处理， 分别产下 74% 的雌性和 68% 的雄性的仔猪。在牛的实验中，根据Cran 等和 Seidel 等的报道，用分离的Y精子进行人工受精或体外受精和胚胎移植后产下的67 头犊牛中， 90% 为公犊牛，用 X精子进行人工受精或体外受精及胚胎移植后后共产下139 头犊牛，其中83% 为母犊牛。在人体实验中，根据Fugger 报道，用 X和 Y精子进行 IUI 、IVF 或 ICSI 后出生后的婴儿中女婴和男婴分别为94% 和 73% 。5 精子分离后的应用实验5.1 用分离精子进行人工授精的研究目前，流动细胞检索分离仪分离精子的技术在不断地改进，分离效率也不断的提高，但是最乐观的估计改进后的分离效率，也难以提供足够的分离精子用于常规的人工受精。然而通过 AI 技术的改进，如采用比常规AI 更少量的精液授精，可以获得较理想的怀孕率。因此 AI 技术的改进，使分离精子应用于这一领域变成现实。朔州职业技术学院2012 届毕业论文第 4 页 共 6 页Seidel等报道了两项关于他们采用低剂量的精液与流动细胞检索分离仪分离的精子过程相结合的实验结果。在第一项研究中，他们使用的是每秒可分离两种性别的精子各 1000 个的流动细胞检索分离仪，产下的17 头犊牛有 14 头是所预计的性别。第二项研究是采用每秒可分离50006000个 X和 Y精子的高速流动细胞检索分离仪，结果以剂量为 3*105个携带 X 染色体的精子数授精的怀孕率为42% ，采用新鲜活精子授精的对照组，获得 52% 的怀孕率。这些数据与使用的3 头公牛和两种输精器之间是想平衡的。由分离精子授精产下的19 头犊牛中 18 头是母牛。这两项实验中，对于所产下的牛犊情况看，出生体重以及随后的生长发育至今都未出现任何异常，与对照组所获得的没有任何差异。用分离精子进行AI 实验，在其他家畜如马、羊、猪中也有报道。说明用分离精子进行 AI 是可行的。5.2 用分离精子进行 IVF 或 ICSI 的研究用流动的细胞检索分离仪分离的精子可以满足体外受精的实验，利用精子分离技术与体外授精相结合生产动物后代，最早是在英国剑桥生物有限公司（ABC ）展开的。Cran等是最早开展这项研究的，他们把分离精子授精后产生的胚胎移植到9 头受体母牛，其中 4 投怀孕，并产下 6 头 （3 投母犊牛和 3 头公犊牛）预选性别的犊牛，性别准确率 100% 。1995 年，Cran 等又进行了第二项研究，即用分离的Y精子生产雄性犊牛的实验。他们将由分离的 Y 精子进行 IVF 后获得的 106 枚胚胎冷冻后进行移植，共产下41 头犊牛，其中 37头为公犊牛，雄性比例为90% 。此外，美国 XY公司的研究人员在用分离精子进行IVF 的研究中发现，非必需氨基酸在受精液中对促进受精卵第一次分裂即随后的发育有显著作用，以及在培养液中添加胰岛素也可以促进分离精子IVF 后的胚胎发育及提高胚胎的质量。因此，目前由于用分离精子的 IVF 系统的改善，不仅使分离精子IVF 后的胚胎发育迟缓现象得以克服，而且分离精子 IVF 后的卵裂率、囊胚发育率及囊胚内的细胞数已达到正常精子的水平。用分离的精子进行单精子胞质内注射的研究不多，目前只在羊和牛中有报道。1996年，Catt 等用分离的 Y精子进行 ICSI 后获得了 1 只公羔羊。1999 年，Hamano 等用分离了的牛精子进行 ICSI 后获得了 8 头公犊牛和 2 头母犊牛，其性别准确率达80% 。6 精子分离技术在实际中的应用朔州职业技术学院2012 届毕业论文第 5 页 共 6 页6.1 精子分离技术在畜牧业生产中的应用在一个物种内雄性与雌性间存在形式上、功能上以及价值上的差异，这种差异成为性别的二型性。对于奶用和肉用牛生产者来说，这一现象是普遍存在的重要特征。对于存在有二型性的牛来说，在一个特定的交配中，有时人们期望获得雄性，而在另一些时候人们期望的也许是雌性。 这一性别二型性的存在为分离精子的商业化开发创造了机会。从事牛奶生产的农场主们通常用自己生产的有价值的小母牛进行种群替换。为了改善奶牛的遗传价值，他们到种子站购买经过高度挑选了的公牛的精液，希望尽可能迅速和经济地生产出有价值的小母牛，用分离得精液可以帮他们实现这一目的。对于从事商业性肉用牛生产的农场主来说，他们生产小牛的目的是最终卖给屠宰场，以及进行雄性种群替代。因此，商业肉用牛生产者们可以利用分离精子来有效调整犊牛的比例。分离精子商业化生产的市场是巨大的。 英国的 Cogent 公司是世界上首家分离技术投入商业化生产的公司， 他们用流动细胞检索分离仪为其属下的牧场主提供奶牛分离精子的服务。目前，该市场处于供不应求的状况。美国、瑞士、日本、澳大利亚以及德国目前也在进行用流动细胞检索分离仪分离精子的研究和实验工作，预计近一、二年也将应用于商业化生产。6.2 分离精子在人临床上的应用有许多分离精子的方法曾在人临床上进行过应用，其中白蛋白梯度离心法曾在美国的 27 家诊所和其他国家的16 家诊所中使用。尽管出生时观察到性别比例有一些改变，但在通过 FISH法在分析， 该法兵没有真正将携带X染色体和携带 Y染色体的精子分开。最早开展用流动细胞检索分离仪分离人精子的研究和临床应用的研究机构是美国弗吉尼亚州的遗传与体外受精研究所。他们开展的第一例由流动细胞检索分离仪分离的精子受精后怀孕和出生的，是一个为患病的X连锁脑积水携带者的女儿。随后，该研究所Fugger 等又将流动细胞检索分离仪分离精子技术与IVF/ICSI以及植入前胚胎诊断相结合，将未受影响的胚胎进行移植。共为 332 位病人用分离的精子进行IVF、ICSI 或 IUI ，其中为防止X 连锁疾病的人占13.9%（46/332 ） ，为平衡家庭性别比例的占86.1%（286/332） 。 用分离精子分别进行IUI 和 IVF/ICSI 之后，共有 96 位母亲怀孕。其中 IUI的有 61人， IVF/ICSI 的有 35人。 结果 IUI 和 IVF/ICSI 的怀孕率分别为 11.8%和 24.1%.已经检测出或已经出生的后代，其性