实验五 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量一、实验目的1. 掌握考马斯亮蓝染色法定量测定蛋白质含量的原理与方法2. 熟练分光光度计的使用和操作方法。二、实验原理考马斯亮蓝 G250 测定蛋白质含量属于染料结合法的一种，它与蛋白质的疏水微区相结合， 这种结合具有高敏感性。 它在酸性溶液中呈棕红色， 最大光吸收峰在 465nm，当它与蛋白质结合形成复合物时，其最大吸收峰改变为595nm。考马斯亮蓝 G-250蛋白质复合物呈蓝色，在一定范围内，595nm 下光密度与蛋白质含量呈线性关系， 故可以用于蛋白质含量的测定。考马斯亮蓝结合法是近年来发展起来的蛋白质定量测定法，本方法具有操作方便、 快速、干扰因素少的特点。离心机的使用说明：1.要离心的离心管和管套要称重，重量不等时将水加在管套里。2离心管的放置是对角线放置，要求必须对称。3. 先将离心机转速旋钮恢复到零刻度后， 再定时间， 定好时间后缓慢旋转转速旋钮，使离心机均匀的提速到预定转速。分光光度计的使用说明：1.接通电源开关，预热20min 后，再选择须用的单色光波长。2.放入已加入溶液的比色皿，盖上样品室盖，推动试样架拉手，使对照比色皿（溶液装入45 高度，置第一格）置于光路上，调节100透射比按钮，使吸光度值A=0.00。3.推动试样架拉手，使样品比色皿置于光路上，读出吸光度值。4.测量完毕，取出比色皿， 洗净后置于乙醇溶液中浸泡脱色。5.电源开关置于“关”，拔下电源插头。三、试剂与器材：1. 试剂：（1）0.9NaCl：9g NaCl 溶解在 1L 的容量瓶中。（2）标准蛋白质：称取50mg 结晶牛血清蛋白定溶于50ml 容量瓶里。（3）染液：考马斯亮蓝 G-250 0.5g，溶于 250mL95%乙醇，再加入 500mL85(WV)磷酸，保存于棕色瓶中，称为母液。取150 mL 然后加蒸馏水定容到1000mL，保存于棕色瓶中，备用。2. 器材：试管；吸管 10mL、l5mL、lmL、0.1mL；722分光光度计四、 操作方法1. 标准曲线的制备取 6 支试管，按下表加入各试剂：以各管相应标准蛋白质含量（mg）为横坐标、 A595 为纵坐标，绘制标准曲管号 012345标准蛋白溶液(ml)00.20.40.60.81.00.9%NaCl 溶液(ml)1.00.80.60.40.20待测样品(ml)考马斯亮蓝试剂(ml)5.05.05.05.05.05.0摇匀，放置5min，测吸光度值A595nm线。2. 待测样品测定试管中加蛋白质样品1.0mL ， 再加入 5.0mL 考马斯亮蓝 G-250 试剂， 摇匀，放置 5min 后，在 595nm波长下吸光度值， 记录 A595。根据所测 A595 从标准曲线上查得蛋白质含量。并计算蛋白样品的浓度（mg/ml） 。五、实验结果及分析六、思考题蛋白质含量的测定还有哪些方法？其优缺点是什么？