单克隆抗体药物 抗肿瘤的生物技术药物,杨春华 讲师 2014.5.14,2007年全球医药市场达到6750亿美元左右，增速为5-6%，其中生物 制药市场收入为450亿美元，增速为13-14% 。 生物制药占医药产业8.8-10%，其中美国市场占62%，欧洲占25%， 日本占7%。 美国已产业化的基因工程药物200种，占药品总销售额的10%。 我国生物技术药物研究和开发起步较晚，已有20多种基因工程药物和 疫苗上市，正在进行临床试验的品种近100种。 2005年我国医药生物技术产品总销售额达到350亿元。,至2008年底，FDA 共批准99种生物技术药物上市 2007年29/110种生物技术药物的销售额超过10亿美元 2007年销售额超过40亿美元的药物有16种，基因工程药物占据7种：1. 治疗非霍奇金淋巴瘤的 anti-CD20 抗体 Rituxan 2. 治疗乳腺癌的anti-EGFR II 抗体 Herceptin 3. 治疗肿瘤放化疗后出现的白细胞减少的 G-CSF 4. 治疗肺癌、乳腺癌和结直肠癌的 anti-VEGF 抗体 Avastin 5. 治疗类风湿关节炎的 anti-TNF抗体Enbrel、Remicade,单克隆抗体药物,Monoclonal Antibodies on the Market,1979 - 1980 国内个别单位开始单抗的研制1984年以前 基本是技术方法的建立和完善1985年以后 单抗为基础的诊断试剂用于研究和临床1987年以后 单抗的体内诊断和治疗制剂被列 入863计划1992年 我国第一个单抗衍生物被SDA批准进入临床2005年 第四军医大学研制的治疗肝癌新药碘131 美妥昔单抗注射液，这是全球第一个专门用于治疗原发性肝癌的单抗导向同位素药物.,单克隆抗体技术在我国的发展.,由分化成熟的终末B细胞-浆细胞合成、分泌的一类能与相应抗原（ antigen ，Ag ）特异性结合的具有免疫功能的糖蛋白。,什么是抗体（ Antibody，Ab ）？,Ag,1,2,3,4,B,抗体 ，Ab,一个 B 细胞只能生产一种抗体，对付某一 抗原決定基。,B1,B2,B3,B4,多克隆抗体,B4,B4,B4,单克隆抗体,在V区中，某些特定位置的氨基酸残基的组成和排列顺序高度可变，称为HVR，或互补决定区（CDR）。 VL区和VH区各存在个3CDR FR14为骨架区，稳定HVR的结构。Fab段：抗原结合片段 Fc段：可结晶段,Fab,Fc,抗体的发展过程,单克隆抗体,基因工程抗体,多克隆抗血清,抗体库,传统抗血清,抗 原,免 疫,所有抗体混合,1,2,3,4,多克隆抗体,单克隆抗体,1975年建立了单克隆抗体技术（淋巴细胞杂交瘤技术）。1984年获得诺贝尔医学和生理学奖。,B淋巴细胞,注射特定抗原蛋白,骨髓瘤细胞,培养骨髓瘤细胞,融合,B淋巴细胞,骨髓瘤细胞,杂交瘤 BB B 瘤 瘤瘤,HAT选择培养液（黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶） 选择培养 骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶而死亡,检测到所需的X抗体,分离单个细胞进行克隆化培养,检测到所需的X抗体,注入小鼠腹腔,扩大培养,体外培养,大量单克隆抗体,鼠单抗,人单抗,大鼠,小鼠,产量高、操作比小鼠麻烦 少用,易操作、多用,HAMA反应,人人杂交瘤,人B细胞、骨髓瘤细胞融合,人鼠杂交瘤,人B细胞、鼠骨髓瘤细胞融合,细胞杂交瘤技术,21,单克隆抗体的不足：目前单克隆抗体均是鼠源性抗体，应用于人体内可产生人抗鼠抗体（human antimouse antibody, HAMA) 人体的排斥反应 人体内半衰期只有5-6小时 到达靶组织的药量仅有1,基因工程抗体,鼠单抗 100% 鼠源,鼠/人嵌合单抗 (66-75 % 人源),人源化单抗 (90-95 % 人源),100% 人源,为了降低免疫原性，降低相对分子量，增加穿透力，开发了新的基因工程抗体。,恒定区人源化,可变区人源化,Pr 鼠VH 人 CH Pr 鼠VL 人 CL,免疫球蛋白 基因载体的构建,H链嵌合载体,L 链嵌合载体,共转染细胞,启动子,人-鼠嵌合抗体基因工程改造策略,鼠VH,鼠VL,人CL,人CH,抗体分泌细胞,CDR序列,CDR序列,鼠单克隆抗体,人抗体,人源化抗体,CDR移植,小分子抗体,小分子抗体的优点： 分子质量小，免疫原性低。 易于进入实体瘤周围的微循环。 无Fc片段，不易与具有Fc受体的非靶细胞结合，用于免疫诊断时成像清晰。 构建较简单，易于操作和改造。 可在细菌中表达，易于大量生产。小分子抗体的缺点： 与抗原结合活性相对较弱。 半衰期短。,抗体库,抗体库技术：用基因克隆技术克隆全套抗体的重链和轻链的可变区基因，然后重组到特定的表达载体中，转化特定的宿主细胞表达有功能的抗体分子，并通过亲和筛选获得特异性抗体可变区基因的技术。利用抗体库技术筛选到的抗体可变区基因可被用于构建基因工程抗体。,噬菌体抗体库,抗体库的优点：越过了细胞融合的步骤，省时省力。 扩大了筛选容量，易于获得高亲和力抗体。 不需进行人工体内免疫。,单克隆抗体药物：Trastuzumab,商品名：赫赛汀 英文名：Herceptin 通用名：注射用曲妥珠单抗 (Trastuzumab )针对HER2的特异性单克隆抗体，用于治疗HER2过度表达的 转移性乳腺癌,重组DNA衍生的人源化单克隆抗体 可单药使用,不良反应轻，耐受性好,可在门诊治疗 疗效显著，中位缓解时间长,HER2人类表皮生长因子受体-2Human Epidermal growth Factor Receptor-2 分子量185 kDa的糖蛋白: 细胞外区（配体结合区） 跨膜区（传导信号） 细胞内区（激酶活性）,Cell membrane,基因转录,提高细胞运动,抑制凋亡,细胞生长和增殖,转移,化疗耐药,肿瘤生长,EGF,EGFR,EGFR,TGF,TGF,EGFR,HER2,HER2,HER3,NRG,NRG,HER2,HER4,HER2,HER2,信号级联放大,核膜,Intracellular,1 = 基因拷贝数 2 = mRNA 转录 3 = 细胞表面受体蛋白表达 4 = 细胞外受体功能域释放,A = HER2 DNA B = HER2 信使RNA C = HER2 受体蛋白,细胞核,细胞质,细胞膜,1,2,3,4,C,B,A,HER2阳性：过度表达/扩增,HER2正常表达 细胞 (HER2) (2万个受体）,HER2过表达的细胞(HER2+) (100200万个受体）,正常HER2 表达,HER2 基因扩增导致HER2过表达,HER2 过表达导致肿瘤增殖,促进细胞的生长和增殖-肿瘤发生 抑制细胞的凋亡 诱导血管新生 提高细胞运动能力,增强肿瘤的浸润转移作用,HER2在癌症中过表达：30以上的人类肿瘤中存在HER2基因的扩增/过度表达（如乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜 癌、输卵管癌、胃癌和前列腺癌等。2030的原发性浸润性乳腺癌有HER2基因的扩增/过度表达。 Herceptin即为一种针对HER2受体的人源化单克隆抗体，是乳腺癌治疗领域的第一个分子靶向性药物，具有高效、低毒、选择性强的特点。 2010年，欧洲和美国先后批准化疗联合使用曲妥珠单抗治疗HER2阳性胃及胃食管交界癌患者。,癌细胞表面存在着Her-2蛋白， 受刺激后促进癌细胞的增殖2030的癌细胞。,Heceptin与Her-2结合阻断和抑制细胞的增殖，用于 转移性乳腺癌病人的治疗。,HER2检测流程,免疫组织化学,原位杂交,440mg 冻干粉针剂 20ml 无菌注射用水,赫赛汀用法用量,所需溶液的体积 = 体重（Kg）剂量（4mg/Kg负荷量或2mg/Kg维持量）21（mg/ml，配置好溶液的浓度）,曲妥珠单抗辅助治疗可以选择的方案,单克隆抗体药物： Rituximab,商品名：美罗华英文名：Mabthera 通用名：利妥昔单抗(Rituximab )针对CD20的特异性单克隆抗体，通过基因重组技术生产的一种嵌合鼠/人的单克隆抗体,用于治疗非霍奇淋巴瘤。,非霍奇淋巴瘤（non-hodgkins lymphoma，NHL）瘤细胞成分单一，大多起源于B淋巴细胞，部分来自T淋巴细胞，只有少数来自组织细胞。故目前多倾向于根据细胞形态结合免疫功能分类：,B细胞淋巴瘤（临床多见） T细胞淋巴瘤,CD20抗原在从前B细胞到活化 B细胞的各个阶段都表达,但在正常造血干细胞、分化成熟的浆细胞及其他类型造血细胞系却未见表达，且CD20在超过90%的 B细胞性NHL中均有表达。因此CD20成为肿瘤治疗的一个较好的靶点。,Rituximab：通过ADCC，CDC 促凋亡 与化疗药物协同作用,淋巴瘤治疗单克隆抗体,Rituxi-CD20,CD20,Epratuzumab：人源性IgG1抗CD22单抗60%80的B-NHL细胞表达CD22 滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤和边缘区B细胞性淋巴瘤高表达CD22 Anti-CD22与CD22结合后迅速内在化,抗CD22单抗,其他针对B,T细胞的单抗,Epratuzumab I/II期临床试验 结果,抗CD30单抗,CD30 在霍奇金淋巴瘤的RS细胞和间变大细胞淋巴瘤高度表达，是治疗淋巴瘤的理想靶点嵌合性CD30单抗SGN-30及人源化CD30单抗MDX-60治疗耐药性HD、ALCL 和其他CD30+淋巴瘤的I/II期临床试验正在进行中,抗CD40抗体,CD40在恶性T和B淋巴细胞中表达，CD40被认为与细胞的增殖及分化相关。SGN-40是一种人源化IgG1型抗CD40抗体，临床前研究表明其对淋巴瘤细胞具有明显的杀伤效应。目前正在DLBCL中进行两项II期临床试验，一项为SGN-40单用，另一项为SGN-40与细胞毒性药物联合应用。,抗CD80抗体,CD80为淋巴瘤治疗中的另一靶点，其表达在不同时期的B细胞和霍奇金淋巴瘤细胞表面，其参与T和B淋巴细胞的激活。Galiximab是一种人-灵长类嵌合型抗CD80抗体，临床研究表明在复发FL中具有较好的安全性和有效性。目前正在复发FL中进行III期临床试验，比较美罗华联合Galiximab与美罗华单用之间的疗效。美罗华联合Galiximab治疗初治FL的临床试验也在进行。,抗CD52单抗,CD52表达于不同分化阶段的淋巴细胞，以及单核、巨噬和嗜酸性粒细胞。表达T-PLLB-CLL正常B细胞Alemtuzumab(Campath-1H，阿仑单抗)为人源性IgG1型单抗 FDA已批准Alemtuzumab作为氟达拉滨耐药的CLL的一线治疗，可单独使用Alemtuzumab单独用于CLL疗效优于瘤可宁等化疗药,单克隆抗体药物： Bevacizumab,商品名：阿瓦斯汀英文名：Avastin 通用名：贝伐单抗 （Bevacizumab）针对VEGF（ vascular endothelial growth factor ，血管内皮生长因子）的人源化单克隆抗体，通过与肿瘤细胞分泌的VEGF特异性结合,阻碍VEGF经由VEGF-1和VEGF-2受体进行的信号传导，阻止肿瘤细胞中新血管的生成，起到抑制肿瘤细胞增殖的作用，主要用于治疗结肠癌。,