血 清 蛋 白 的 醋 酸 纤 维 薄 膜 电 泳,生 物 化 学 实 验,一、实验目的,学习醋酸纤维薄膜电泳的操作，了解电泳技术的一般原理,二、实验原理,电泳是指带电质点在电场中向本身所带电荷相反的电极移动的现象。在一定pH条件下，不同的质点由于具有不同的等电点而带不同性质的电荷，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，即它们的电泳迁移率不同，因此，可使它们分离 影响电泳迁移率的外界因素：电场强度、溶液的pH值、溶液的离子强度和电渗现象 影响电泳迁移率的内在因素：质点所带净电荷的量、质点的大小和形状 采用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法称为醋酸纤维素薄膜电泳。醋酸纤维素薄膜电泳具有微量、快速、简便、分辨力高，对样品无拖尾和吸附现象等优点 醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维素醋酸酯，将它溶于有机溶剂（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状的结构，厚度约为120 m，有很强的通透性，对分子移动阻力很小,三、实验仪器,1、DYY-8C型常压电泳仪：北京六一仪器厂生产，1套/2组,2.醋酸纤维薄膜（2 cm8cm）：2片/人。 3.培养皿：一排桌子（即4组）公用5套，包括平衡、染色各用一套，漂洗用3套。 4.点样器：一个/组。 5.滤纸：公用。 6.玻璃板：一块/组。 7.镊子：一个/组。 8.玻棒：公用。,四、实验试剂,1巴比妥缓冲液（pH8.6，离子强度0.07）：巴比妥2.76g，巴比妥钠15.45g，用蒸馏水定容至1000mL。 2染色液：氨基黑10B 0.25g，用甲醇50mL、冰醋酸10mL、水40mL溶解（可重复使用）。 3漂洗液：甲醇或乙醇45mL，冰醋酸5mL，水50mL，混匀。4.人或动物血清：从医院或自制，冰冻保存，现取现用,五、实验过程,浸泡：将28 cm醋酸纤维薄膜迎着光辨别光泽面和无光泽面。将粗糙面朝上置于盛有缓冲液的平皿中，浸泡20min方可用于点样点样：用镊子取出浸透的薄膜，夹在两层粗滤纸内吸干多余的缓冲液，然后平铺在玻璃板上（无光泽面朝上）。在另一载玻片上滴一滴血清，点样器（用盖玻片的一边）在血清上蘸一下（可来回移动一次），再将点样器轻印在加样线上，使血清渗透到薄膜内，形成均匀的直线,五、实验过程,电泳槽的准备：根据电泳槽膜支架的宽度，裁剪尺寸合适的滤纸条。在两个电极槽中，各倒入等体积的电泳缓冲液，在电泳槽的两个膜支架，各放两层滤纸条，使滤纸一端的长边与支架前沿对齐，另一端浸入电泳缓冲液中。当滤纸全部润湿后，用玻璃棒轻轻挤压在膜支架上的滤纸以驱赶气泡，使滤纸的一端能紧贴在膜支架上，即为滤纸桥,五、实验过程,电泳：将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上（点样面朝下），另一端平贴在阳极端支架上。盖上电泳槽盖，使薄膜平衡10 min。通电，调节电压至160 V，电流强度为0.40.6 mA/cm膜宽度，电泳时间约25 min 染色：电泳完毕后将薄膜取下, 放在含氨基黑10B染色液的培养皿中浸泡5 min漂洗：将薄膜从染色液中取出后移置漂洗液中漂洗数次，直至背景蓝色脱尽，条带清晰为止，可得到色带清晰的电泳图谱,六、注意事项,保持薄膜清洁，务必戴上塑料手套，勿用手指接触薄膜表面，以免油污或污物沾上，影响电泳结果。 注意醋酸纤维膜的质量，至少浸泡10分钟，浸泡很久仍有大块白色硬点者须弃之不用。 加样时一定要呈直线、垂直、分布均匀，这样泳动的区带整齐、不歪。以免影响蛋白质区带图谱的完美。 电泳槽两边的缓冲液应保持液面在同一水平面上，槽里的缓冲液要保持清洁。 电泳电压大小，时间长短与缓冲液的离子强度都有一定的关系。一般电流约0.40.6mA/cm,电压110160V，通电时间4060min。电压高，电流大，电泳速度加快，时间可缩短，但薄膜上蒸发严重，因此不能无限增大电流。 使用比色皿时要润洗。 染色的同时也是蛋白质的固定，所以，不要将很多蛋白条重叠在一起。 注意薄膜正负极不要搭反，注意簿膜的正反不要放反。放的时候注意血样不要与滤纸接触了。 通电完毕时，必须切断电源，以防触电事故。,七、实验结果,从左至右分别为血清蛋白、1-球蛋白、 2-球蛋白、-球蛋白、-球蛋白、点样处,04,06,07,09,八、失败图谱分析,拖尾状：点样量过多，被分离的血清蛋白不能分离成5条区带或产生拖尾。 有斑点：点样不均匀，不整齐，导致被分离的区带出现斑点。 边流现象：点样板蘸取血清一边多一边少，导致区带分离不清，出现边流现象。 区带模糊：薄膜过湿，样品扩散迅速，导致样品分离不成区带。 锯齿状：薄膜用滤纸吸水过度（薄膜上出现白斑）或点样过慢，又未及时大桥，导致薄膜过于干燥，使区带成锯齿状。 区带倾斜：薄膜搭载滤纸上的位置歪斜，弯曲，与电流方向不平行，或点样一边多一边少，区带容易泳斜。 显色过浅：点样太少，区带显色不明显。 区带重叠：染色时，醋酸纤维薄膜不是一张一张放入染色液的，在染色固定前，薄膜与薄膜之间重叠，造成薄膜上还未固定的血清蛋白彼此粘连。 区带过密：电泳时电压，电流或电泳过小或时间不够，造成区带未分离。,实验结果既有清晰的图谱，也有模糊不清的图谱,九、实验思考,1、为什么要将点样一端放在电泳槽的负极？答：带电质点在电场中向本身所带电荷相反的电极移动。因为血清样品带负电荷，在电场中将向正极泳动，所以点样端要置于负极。2、电泳时电压表显示的电压是否等于加在膜条两端的实际电压，为什么？答：不相等。因为在实际中缓冲液两边离子不平衡。,九、实验思考,3、根据人血清中蛋白各组分的等电点，估计它们在pH8.6的巴比妥电极缓冲液中电泳移动的相对位置。答：,巴比妥电极缓冲液的pH为8.6，蛋白的等电点均低于它，因此蛋白带负电荷，向正极移动。速度为血清蛋白1-球蛋白 2-球蛋白-球蛋白-球蛋白。因此，在电泳图谱上位置由左向右依次为血清蛋白、1-球蛋白、 2-球蛋白、-球蛋白、-球蛋白。,