- 1 - 转基因技术在大豆育种上的应用摘 要：常规育种技术存在育种年限长、难以打破性状连锁、多基因重组几率低、远缘杂交困难等问题，难以满足日益增长的对大豆品质和产量的需求。目前，大豆遗传转化的主要方法有 : 农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法等。本文主要对大豆遗传转化的受体系统、常用转化方法的主要影响因素以及未来大豆遗传转化的发展趋势等方面进行了综述。关键词： 转基因，大豆育种，遗传转化，受体系统前 言：大豆属于豆科、蝶形花亚科、大豆属的二倍体(2n = 40) 植物起源于中国后传入日本、欧洲、美国等地。大豆是一种非常重要的农作物市场需求量大但是在生产过程中经常受病、虫害以及干旱等不利条件的影响产量极不稳定。因此培育抗病虫、高产、优质大豆新品种对促进农业生产、提高人类生活水平等有着重要意义。常规育种技术由于存在育种年限长、难以打破性状连锁、多基因重组几率低、远缘杂交困难等问题难以满足日益增长的对大豆品质和产量的需求。现代生物工程技术可以打破生物之间的界限实现遗传物质的重新组合为大豆的育种工作开辟了一条全新的途径。相对于水稻、烟草等作物而言大豆的有效再生体系以及高效遗传转化系统的建立一直是植物基因工程领域的重点和难点近年来随着现代生物技术的飞速发展大豆遗传转化的研究取得了较大的突破。大豆遗传转化的主要方法有: 农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法、子房注射法、电击法、农杆菌介导和基因枪结合转化法、超声波辅助农杆菌介导法等应用最为广泛的是农杆菌转化法其中根癌农杆菌介导大豆子叶节的遗传转化系统最为有效。笔者对大豆遗传转化的受体系统、常用转化方法的主要影响因素以及未来大豆遗传转化的发展趋势等方面进行了综述。正 文1 大豆遗传转化受体系统的研究- 2 - 大豆高效再生系统是其进行遗传转化的必要前提。大豆组织培养常用的外植体有子叶节、成熟或未成熟胚、胚轴、胚尖、半种子等诱导途径主要有器官发生途径和体细胞胚胎发生途径两种。1. 1 大豆器官发生途径1973 年 Kimball等以大豆下胚轴为外植体在B5和 MILLER 培养基上诱导产生不定芽但未能获得再生植株。 Cheng等最早通过器官发生途径获得了大豆再生植株随后不同研究者分别采用不同外植体未成熟胚、成熟胚、真叶、下胚轴、子叶节经过器官发生途径获得了再生植株。近年来国内外报道的大豆再生体系多以子叶节为外植体通过施加外源细胞分裂素( 主要是 6-BA) 来诱导子叶节处潜在的分生组织增殖产生不定芽再经诱导获得再生植株。刘海坤等利用胚尖为外植体建立了一种高效的再生体系其植株再生率达87.7%。1. 2 大豆体细胞胚胎发生途径由于体细胞胚发生途径可以大量获得转基因植株以及大规模提供优良种质是目前大豆遗传转化较为理想的受体系统。大豆体细胞胚胎发生途径常用外植体主要有未成熟子叶、未成熟胚和未成熟下胚轴等。1983Christianson等首次以未成熟胚的胚轴为材料用改良的MS 培养基附加2, 4-D 诱导出体细胞胚胎并获再生植株。随后 Lazzeri等、Ranch等、Barwale 等、Finer 等分别用大豆未成熟胚和未成熟子叶诱导胚状体获得了再生植株。其中 Finer 等 报道的体细胞胚胎悬浮培养被认为是较好的再生体系。该系统的优点是：(一) 胚性细胞团中可增殖的胚性细胞处于表面或近表面且能在许多位点上形成体细胞胚这些胚性细胞接受外源基因能力较强有利于转化； ( 二) 在胚性细胞团增殖培养过程中由于培养液与胚性细胞团充分接触这样在筛选时能更好的解决嵌合体问题。大豆未成熟胚被认为是体细胞胚胎发生途径理想的外植体。1. 3 其他组织培养再生途径植物原生质体培养也是一种重要的再生体系与利用大豆外植体培养再生植株相比其优越性在于容易摄取外源遗传物质但是获得植株困难培养过程繁杂工作量大再生周期长不同基因型差异很大再生效率低以及相关的遗传转化方法( 电击法、- 3 - 脂质体法、PEG 法) 的转化效果也不理想所以在一定程度上限制了该研究在遗传转化上的应用。植物花药培养研究起始于20 世纪 50 年代初期大豆花药培养目前面临的主要是如何突破由愈伤组织诱导出苗以及如何解决诱导频率低等问题如果这些问题得到解决将会加速大豆新品种的选育。2006 年 Franklin G等报道了一种新的大豆再生体系“Florigenesis” ，在MS 培养基中附加 TDZ和 NAA 直接诱导成熟子叶外植体开花产生种荚、获得种子。该方法不经过体细胞胚或器官等植株再生途径在较短的时间内获得种子突变体少但是存在后代不育的问题。2 大豆遗传转化方法植物转基因方法主要有基因枪法、农杆菌介导法、花粉管通道法、PEG 法、电激法、超声波法、碳化硅纤维法等。大豆遗传转化中主要应用的是农杆菌介导法、基因枪法和花粉管通道法。2. 1 农杆菌介导法根癌农杆菌介导的遗传转化法是利用根癌农杆菌侵染受伤植物时可将其质粒上的一段 DNA ( T2 DNA) 整合到受体植物基因组中并能够稳定地在植物体内进行遗传表达的一种转化方法。从Horsch 等首次使用该方法获得转基因植物报道以来已有众多利用此方法获得转基因植物的报道。主要适合于大多数双子叶植物和一些单子叶植物其技术简单成熟耗资少转化率相对较高可以转化较大的外源基因片段(50 kb) 外源基因多以单拷贝形式存在没有明显的基因重排现象后代分离遵循孟德尔遗传规律等诸多优点。Hinchee 等首次以子叶为外植体利用农杆菌侵染法获得转基因大豆。他们从100 个大豆栽培品种中筛选出3 个对农杆菌敏感的大豆基因型 Maple Presto Peking 和 Dolmat。他们用含有 NPT 和 GUS基因或 NPT 和 Glyphosate 基因进行转化经过检测证明得到转基因大豆转化率为6% 。对其后代进行遗传学分析表明分离规律符合孟德尔遗传分离规则。随后 Owens等、 Kudirka等、 Byrne 等研究者们对大豆基因型农杆菌菌株致瘤能力转化条件等做了大量的研究这一时期国内学者王连铮等利用农杆菌的15 个菌系对 2 759 个大豆品种的致瘤能力进行了研究筛选出7 个致瘤能力较强的菌系和858 份作为外源基因转化受体- 4 - 材料。近年来大量的研究者进一步对大豆敏感型农杆菌的转化能力酚类物质如乙酰丁香酮 (AS) 对农杆菌 vir 基因的活化加入L2Cys、DTT 、AgNO3等对减轻受体材料褐化等方面进行了详细地研究均获得了转基因大豆。实践证明根癌农杆菌介导大豆子叶节的遗传转化体系具有在大约3 个月的时间内获得再生植株、外植体不受时间、季节限制的优点但是由于外植体经过激素诱导产生的不定芽起源于多细胞易产生嵌合体植株。 2006 年 Wang等报道了一种农杆菌介导半种子的遗传转化系统将消毒的大豆种子用无菌水浸泡24h 直接取子叶节外植体进行农杆菌转化共培养时间延长为 5d 其转化率达到了 1.4%-7.8%。Liu 和党尉等以大豆胚尖为外植体最高转化率分别达到了15.8%和 18% 是现有报道中效率较高的转化体系。由于胚尖体积小表面光滑胚尖顶端处有较强的分生能力使得共培养时间由3d延长至 5d农杆菌还能被有效的抑制并且胚尖对卡那霉素较敏感从而有效地解决了嵌合体问题是一种较为理想的转化系统。另外也有研究将农杆菌转化方法辅以其他方法如超声波辅助农杆菌转化法(SAAT) 、真空抽滤辅助农杆菌转化法、甘露醇处理与农杆菌结合法、基因枪与农杆菌结合法等也得到了发展这些方法的应用将会进一步提高农杆菌介导的转化效率。2. 2 基因枪法基因枪转化法是利用被加速的、包被着DNA 的微金属颗粒轰击植物组织细胞从而将外源基因转移至几乎所有的植物细胞、组织、器官或原生质体的一种转化方法广泛应用于对农杆菌不敏感的植物的转化。这种转化方法对外植体的基因型没有依赖性具有相对高的转化率而且可以转移多拷贝的重组DNA 或者 DNA片段。但是与农杆菌转化法相比耗资大转移的外源基因片段小(10 kb) 易发生基因重组引起基因沉默。Klein 等首次在洋葱上证明了基因枪转化法的可行性。McCabe等以叶芽分生组织为靶细胞进行轰击首次获得了转基因植株。Christou等利用电击转化法获得了 Gus基因和 HPT ( 潮霉素磷酸转移酶 ) 基因同时稳定表达的转化细胞系。 Finer 等轰击胚性悬浮细胞获得转基因植株Sato 等用带有 Gus 基因的质粒轰击大豆未成熟胚尖和大豆悬浮细胞获得转基因植株Falco 等、 Stew2art 等、 苏彦辉等、Aragao- 5 - 等、Ponappa等、王萍等、 Keito 等都通过基因枪法获得了转基因大豆植株。2. 3 花粉管通道法大豆离体再生以及遗传转化困难性高不经过离体组织培养的转化系统对解决大豆遗传转化具有重要价值。 20 世纪 70 年代我国学者周光宇提出了花粉管通道法利用植物在授粉后花粉在雌蕊柱头上萌发形成的花粉管通道使外源DNA 或基因进入胚囊转化尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞。1987 年雷勃钧等以半野生大豆龙792343321 为供体提取其总DNA 以黑农 35 为受体通过花粉管道将外源DNA 导入获得高产、高蛋白、抗病转基因大豆新品种黑生 101。这是我国通过花粉管通道法育成的第一个大豆品种。1997 年刘德璞等通过花粉管通道法获得了生育期、生长习性、株高、节数、分支数等均倾向供体的抗大豆花叶病毒 (SMV) 的转基因植株。 1999 年徐香玲等将几丁质酶基因转入到栽培大豆品种中通过分子水平检测证明获得了转基因植株。2006 年刘德璞等以吉林 20 号、吉林 30 号、吉林 45 号为供试材料通过花粉管通道法将雪花莲凝集素(Galanthus nivalis agglutinin GNA) 基因进行转化通过接蚜鉴定和PCR 检测从中筛选出转基因植株后代分离符合孟德尔规律转化率约为1 % 。但是迄今为止用这些方法所得到的转基因植物只经过DNA 斑点杂交、 RAPD 和同工酶分析鉴定而没有经 DNA Southern blotting验证。其他非组培遗传转化方法如利用农杆菌介导的植物整体转化法也取得了一定进展。2008 年王全伟等以大豆幼苗的顶端生长点和叶腋生长点为靶点利用注射法进行转录因子DREB1C 基因的遗传转化最终获得6 株 T0 PCR 阳性转基因植株转化率为 9.2%。T1 植株的 PCR 、Southern bloting 和 RT2PCR 鉴定结果表明获得1 株阳性植株。该方法克服了大豆组织培养再生难、转化率低的缺点是一种简单、快捷的非组培遗传转化途径。2. 4 其他转化方法电激法是利用高压脉冲在原生质体膜上形成瞬间通道来摄取外源DNA的一种转化方法。由于原生质体培养技术复杂所以与原生质体结合的电激法研究的较少。以此法进行研究报道的有Christou等、Jones 等、Dhir 等转化的基因多以报告- 6 - 基因或选择标记基因未见以其他目的基因获得转基因大豆再生植株的报道。聚乙二醇介导法 (PEG)是利用生物生理功能来实现外源基因的导入。该方法在水稻、高粱、小麦等重要粮食作物中获得了转基因植株。在国内卫志明等用PEG法将外源基因导入到大豆的原生质体中获得了27 棵转基因植株转化效率为0. 6 % 这是首例通过原生质体转化途径获得再生植株的报道。南相日等通过PEG法将 BT (Bacillas tharingiensis CryIAc) 毒蛋白基因导入到大豆主栽品种黑农35、黑农 37、 合丰 25 和合丰 35 的原生质体中经 PCR 检测 Southern 杂交分析证明 BT 毒蛋白基因已整合到大豆基因组中。碳化硅纤维是一种无机结晶光纤须状物一般试验所用直径约 0.1-1 m 长度范围为 10200m 。 1991 年 Asano 等用碳化硅纤维法对小糠草进行了研究其过程是: 将消毒处理的碳化硅纤维与受体悬浮细胞混合离心后去掉上清加入带有目的基因的质粒溶液后重悬离心反复数次再用超声波处理获得了转基因植株。 200