生物化学实验河南工业大学生物工程学院生物技术系2015.3,Henan University of Technology,实验内容,1. 淀粉含量测定 2. 氨基酸的纸上层析 3. 蛋白质分子量测定 4. 淀粉酶活力测定 5. 蛋白质含量测定 6. 甲醛滴定测氨基氮 7. 酵母RNA的提取、组分鉴定和含量测定 8. 赖氨酸含量测定 9. 凝胶层析法分离蛋白质 10. 蔗糖酶的提取与部分纯化 11. 蔗糖酶活力的测定 12. Bradford法测定蛋白质含量,教学目的,生物化学是专业基础实验课，其先修课程为无机化学、分析化学和有机化学 。其目的是：学习和掌握生物技术，培养动手观察和思维能力。,学习方法,1、预习：实验前必须进行充分的预习和准备，并写出预习报告，做到心中有数，这是做好实验的前提。 2、操作：应按拟定的实验操作计划与方案进行。做到轻（动作轻、讲话轻），细（细心观察、细致操作），准（试剂用量准确、结果及其记录准确），洁（使用的仪器清洁，实验桌面整洁，实验结束把实验室打扫清洁）。 3、在实验全过程中，应集中注意力，独立思考解决问题。自己难以解释时可请老师解答。 4、写实验报告：做完实验后，应解释实验现象，并作出结论，或根据实验数据进行计算和处理。主要包括：a、目的，b、原理，c、操作步骤及实验性质、现象，d、数据处理（含误差原因及分析），e、讨论，f、思考题回答。,实验室守则,生物化学实验室守则是学生实验正常进行的保证，学生进入实验室必须遵守以下规则： 1. 进入实验室，须遵守实验室纪律和制度，听从老师指导 2. 未穿实验服、未写实验预习报告者不得进入实验室进行实验。 3. 进入实验室后，要熟悉周围环境，熟悉防火及急救设备器材的使用方法和存放位置，遵守安全规则。 4. 实验前，清点、检查仪器、明确仪器规范操作方法及注意事项，否则不得动手操作。 5. 使用药品时，要求明确其性质及使用方法后，据实验要求规范使用。禁止使用不明确药品或随意混合药品。 6. 实验中，保持安静，认真操作，仔细观察，积极思维，实验过程中必须有原始记录，不得擅自离开岗位。 7. 实验室公用物品（包括器材、药品等）用完后，应归放回原指定位置。实验废液、废物按要求放入指定收集器皿。 8. 爱护公物，注意卫生，保持整洁，节约用水、电、气及器材。 9. 实验完毕后，要求整理、清洁实验台面，检查水、电、气源，打扫实验室卫生。 10. 实验记录经教师签名认可后，方可离开实验室。,实验一 淀粉含量测定,一、实验目的 1. 掌握旋光仪的操作使用。 2. 了解旋光法测粗淀粉的基本原理。 二、实验原理 在加热及稀盐酸的作用下，淀粉水解并转入盐酸溶液中。在一定的水解条件下，不同谷物淀粉的比旋光度是不同的。其在171195之间，因此可用旋光法测定粗淀粉的含量。,三、实验仪器和试剂,1、主要仪器： （1）旋光仪 （2）电子天平（感量0.0001g） 2、试剂：1盐酸溶液30硫酸锌溶液。15亚铁氰化钾溶液。,四、实验步骤,1.样品的处理在电子天平上称取小麦粉2.5000g置于三角瓶中加入50ml 1%HCl混成浆状（不能有结块）沸水浴中准确加热15min先加1ml 30% ZnSO4混匀再加1ml 15%亚铁氰化钾混匀移至100ml容量瓶中加水定容混匀后过滤弃去最初15ml收集其余滤液。 2.旋光度测定取滤液20ml置于旋光管中，先用1%HCl 调节旋光仪“0”点，然后将样品溶液放入旋光仪中测,六、思考题 样品加盐酸处理时，煮沸时间少于或多于15min会对测定结果产生什么影响？,五 、 结果计算,其中：,实验二 氨基酸的纸上层析,一、实验目的通过对氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。 二、实验原理纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析，滤纸纤维上的OH具有亲水性，因此能吸附一层水作为固定相，而通常把有机溶剂作为流动相。有机溶剂自上而下流动，称为下行层析；自下而上流动，称为上行层析。流动相流经支持物时与固定相之间连续抽提，使物质在两相之间不断分配而得到分离。,三、仪器和试剂,1、主要仪器： （1）层析缸 （2）微量进样器 （3）喷雾器 2、试剂 ： （1）展开剂：乙醇：水：冰乙酸50:10:1 （2）氨基酸溶液：0.5%的赖氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸溶液及它们的混合液 （3）显色剂：0.1%水合茚三酮丙酮溶液。,四、实验步骤,1、平衡：将展开剂（乙醇：水：冰乙酸50:10:1）放入培养 皿中置于密闭容器内使其充满展开剂（24h左右） 2、点样：取滤纸1张用铅笔在距下方2cm处划线并将所得线段分成5等分从而得到4个标记点，用微量进样器分别取5l下列样品phelyspro混合Aa向4个标记点上加样（样品扩散中1cm） 3、展层：将滤纸卷成筒状且不能够重叠，并用棉线扎紧然后垂直放入培养皿中进行展层2h（当展开剂沿到达滤纸长度三分之二时，即可取出）测量展开剂前沿移动距离（a） 4、显色：用0.1%茚三酮-丙酮溶液朝点样面喷雾（不要喷得太多）然后将滤纸置于电炉上方20cm处加热直至斑点出现为止，测量各斑点中心到点样点距离（b）,1计算出各种氨基酸的Rf值，并根据Rf值鉴定出混合氨基酸中的各组分，在层析图谱上标出各氨基酸名称。 2对氨基酸移动快慢的原因给予简要分析。,五、结果计算,六、思考题,实验三 蛋白质分子量测定,一、实验目的掌握电泳基本原理、分类、影响因素, SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳用途,凝胶制备。 二、实验原理聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质相对分子质量的方法，主要是根据各蛋白质组分的分子大小和形状以及所带净电荷多少等因素所造成的电泳迁移率的差别。 在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），使所有蛋白质颗粒表面覆盖一层SDS分子，导致蛋白质分子间原有的电荷差异消失，此时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小。当蛋白质的分子量在15000200000之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈直线关系。,三、仪器和试剂,1主要仪器 （1）电泳仪 （2）电泳槽 2. 试剂 （1）电极缓冲液 （2） PH 7.2 凝胶缓冲液 （3）1%TEMED， （4）30%凝胶储液， （5）10%过硫酸铵 （6）0.1%考马斯亮蓝R250染色液 （4）10%乙酸脱色液,四、实验步骤,1. 电泳槽的安装：取两块玻璃板将带玻璃条的板（高板）放置桌面上在上面放置“U”型橡胶条最后将凹槽玻璃板（低板）压在高板上，置于电泳槽内，用锲子压紧。 2. 凝胶液的制备与灌装：配置20ml凝胶液：在小烧杯中依次加入5ml 30%凝胶储液，10ml PH 7.2 凝胶缓冲液，2ml 1%TEMED，2.2ml重蒸水，0.8ml 10%过硫酸铵混匀立即沿高板内侧倒凝胶液于两板之间直至低板上沿插上梳子放置15min，待胶凝后取下“U”条重新将胶板放置于电泳槽内向外槽内加三分之一槽深电极缓冲液向内槽加入电极缓冲液没过低板最后拔出梳子。 3. 加样：用微量进样器加入7l标准蛋白于中间胶槽内其余槽内加入7l下列样品牛血清蛋白绿豆分离蛋白 4. 电泳：连接电极线，高板外侧接正极，低板内侧槽接负极，打开电源调电流120mA电泳2h（当指示剂前沿超过二分之一胶长时停止） 5. 剥胶：取下胶板倒去电极缓冲液量取指示剂迁移距离和染色剂的前胶长，然后将胶板置于水龙头下方冲玻板四周直至胶与玻璃板分离 6. 染色与固定：将胶板放入染色盒内向其中加入0.1%考马斯亮蓝R250使其浸没置于摇床上染色过夜 7. 脱色：用10%乙酸溶液脱色至谱带清晰，测定脱色后胶长及各谱带迁移距离。,五 、 结果计算,1、计算相对迁移率：2、以相对迁移率MR为横坐标、LgMr为纵坐标，作出分子量标准曲线。 3、求分子量,五、注意事项 130%Acr-Bis是神经毒化合物，操作时要小心，做好个人防护 2过硫酸铵需现用现配 3过硫酸铵和TEMED在灌胶前加入即可 4用微量加样器上样时，勿刺破胶面,根据本实验所学知识，自行设计豌豆凝集素的分离纯化实验。,六、思考题,实验四 淀粉酶活力测定,一、实验目的学习和掌握测定淀粉酶（包括-淀粉酶和-淀粉酶）活力的原理和方法。 二、实验原理淀粉酶主要包括-淀粉酶和-淀粉酶两种。-淀粉酶可作用于淀粉中的-1,4-糖苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，-淀粉酶可从淀粉的非还原性末端进行水解，生成麦芽糖。淀粉酶催化产生的这些还原糖能使3,5-二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。,其反应如右图：,淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准曲线，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。 淀粉酶存在于萌发后的禾谷类种子中，其中主要是-淀粉酶和-淀粉酶。两种淀粉酶特性不同，-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速钝化。-淀粉酶不耐热，在7015min钝化。根据它们的这种特性，采用加热的方法钝化-淀粉酶，测出-淀粉酶的活力。在非钝化条件下测定淀粉酶总活力（-淀粉酶活力+-淀粉酶活力），再减去-淀粉酶的活力，就可求出-淀粉酶的活力。,三、仪器和试剂,主要仪器： （1）离心机 （2）分光光度计 试剂 （1）标准麦芽糖溶液（2mg/mL） （2）1%3,5-二硝基水杨酸试剂 （3）1%淀粉,四、操作步骤,以麦芽糖含量（mg）为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。,1标准曲线的制作（每2组4人做1标准曲线）,2. 淀粉酶液的制备：在电子天平上称取小麦芽（在9428冰箱内，用后放回）0.5g置于研钵中加20ml水研成浆状转移至离心管中2000转/分离心5min（注意离心前对称放置的离心管应在天平上平衡）取上清液于100ml容量瓶中加水定容混匀即得淀粉酶原液用于-淀粉酶活力测定吸取原液5ml于100ml容量瓶中加水定容即得淀粉酶稀释液用于总酶活力测定。 3. 淀粉酶活力测定-淀粉酶活力测定吸取原液1ml于具塞试管中70保温15min用于钝化-淀粉酶加1ml 1%淀粉置于40水浴中保温5min加1% 3.5一二硝基水杨酸2ml 沸水加热5min后加水至20ml混匀测A1（用1#管调零）总酶活力测定吸取稀释液1ml于具塞试管中加1ml 1%淀粉40保存5min加入1% 3.5一二硝基水杨酸2ml沸水加热5min后加水至20ml混匀测A2（用1#管调零）,五、结果计算,-淀粉酶活力（）淀粉酶总活力-淀粉酶活力 麦芽糖含量从标准曲线上查得麦芽糖的毫克数原液体积为100 稀释倍数为20 规定：40度5分钟内淀粉酶水解淀粉产生1mg麦芽糖为1个活力单位（u）,六、附 注,1样品提取液的定容体积和酶液稀释倍数可根据不同材料酶活性的大小而定。 2为了确保酶促反应时间的准确性，在进行保温这一步骤时，可以将各试管每隔一定时间依次放入恒温水浴，准确记录时间，到达5min时取出试管，立即加入3,5-二硝基水杨酸以终止酶反应，以便尽量减小因各试管保温时间不同而引起的误差。同时恒温水浴温度变化应不超过0.5。 3如果条件允许，各实验小组可采用不同材料，例如萌发1d、2d、3d、4d的小麦种子，比较测定结果，以了解萌发过程中这两种淀粉酶活性的变化。,七、思考题,1为什么要将试管中的淀粉酶原液置70水浴中保温15min？ 2为什么要将各试管中的淀粉酶原液和1%淀粉溶液分别置于40水浴中保温？,实验五 蛋白质含量的测定,一、实验目的学习凯氏定氮法的原理和操作技术。 二、实验原理含氮的有机物与浓硫酸共热时，其中的碳、氢二元素被氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借水蒸汽将产生的氨蒸馏到一定浓度的过量硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液中氢离子浓度降低，然后用标准无机酸滴定，直到恢复溶液中原来氢离子浓度为止，最后根据所用标准酸的摩尔数（相当于待测物中氨的摩尔数）计算出待测物中的总氮量。,