生物制药工艺与设备论文1 重组人工胰岛素制备工艺的研究及其进展徐 邢 宾河 北 科 技 师 范 学 院 生 命 科 技 学 院 生 物 技 术 专 业 0902 班指 导 老 师 ： 张 帆摘 要 :据WHO 统 计 ， 全 世 界 糖 尿 病 患 者 已 接近 1.2 亿 ， 而 我 国 目 前 糖 尿 病 患 者 的 总 数 已 达到 3000 万 人 ， 跃 居 世 界 第 二 位 ， 其 中 数 百 万 患 者 长 期 使 用 胰 岛 素 治 疗 。 如 今 我 国 经 济 发 展 迅 速 ，同 时 也 带 来 了 巨 大 生 活 的 压 力 和 健 康 问 题 ， 并 且 带 有 一 定 的 遗 传 因 素 ， 数 百 万 患 者 需 要 长 期 使 用胰 岛 素 治 疗 。 胰 岛 素 是 由 胰 岛细 胞 受 内 源 性 或 外 源 性 物 质 如 葡 萄 糖 、 乳 糖 、 核 糖 、 精 氨 酸 等 的刺 激 而 分 泌 的 一 种 蛋 白 质 激 素 。而 目 前 临 床 使 用 的 胰 岛 素 有 三 种 来 源 ：1、动 物 胰 岛 素（ 从 猪 和 牛的 胰 腺 中 提 取 ， 两 者 药 效 相 同 ， 但 与 人 胰 岛 素 相 比 ， 猪 胰 岛 素 中 有 1 个 氨 基 酸 不 同 ， 牛 胰 岛 素 中有 3 个 氨 基 酸 不 同 ，因 而 易 产 生 抗 体 ） 。 2、半 合 成 胰 岛 素（ 将 猪 胰 岛 素 第 30 位 丙 氨 酸 ，置 换 成 与人 胰 岛 素 相 同 的 苏 氨 酸 ， 即 为 半 合 成 人 胰 岛 素 ） 。 3、 重 组 人 工 胰 岛 素 （ 利 用 生 物 工 程 技 术 ， 获 得的 高 纯 度 的 生 物 合 成 人 胰 岛 素 ，其 氨 基 酸 排 列 顺 序 及 生 物 活 性 与 人 体 本 身 的 胰 岛 素 完 全 相 同 ） 。可见 第 三 种 方 法 是 目 前 最 好 的 副 作 用 最 小 ， 而 且 简 单 安 全 的 方 法 。 所 以 针 对 重 组 人 工 胰 岛 素 的 制 备做 了 以 下 研 究 。关 键 词 : 重 组 人 工 胰 岛 素 ； 大 肠 杆 菌 ； (His)6一 Arg Arg 一 人 胰 岛 素 原 ；在 当 今 世 界 范 围 内 ， 诺 和 诺 德 、 辉 瑞 、 万 安 特 以 及 我 们 国 内 的 通 化 东 宝 、 深 圳 科兴 等 生 物 技 术 公 司 在 胰 岛 素 的 生 产 技 术 上 已 经 都 是 很 先 进 的 水 平 了 ， 也 就 是 重 组 人 工胰 岛 素 的 制 备 方 法 。这 种 方 法 是 自 从 动 物 中 提 取 胰 岛 素 和 人 工 合 成 胰 岛 素 的 方 法 以 来 ， 最 简 便 而 且 是最 有 效 最 安 全 的 制 备 胰 岛 素 的 方 法 。 它 是 发 酵 工 程 技 术 和 基 因 工 程 技 术 结 合 的 产 物 ，也 是 造 福 人 类 的 新 一 代 药 物 生 产 方 法 。 不 仅 在 治 疗 糖 尿 病 方 面 的 作 用 突 出 ， 同 时 对 治疗 癌 症 等 严 重 影 响 人 类 健 康 的 疾 病 的 治 疗 开 创 了 思 路 。所 以 ， 作 为 本 科 生 的 生 物 技 术 专 业 制 药 方 向 的 大 学 生 来 说 ， 这 种 利 用 基 因 工 程 ，发 酵 工 程 等 方 法 工 业 制 备 胰 岛 素 的 原 理 和 流 程 的 工 艺 ， 和 这 种 开 拓 创 新 的 思 维 是 我 们必 须 要 了 解 和 学 习 得 。1 重组 人工 胰 岛素 的 生 产原 理通 过 基 因 工 程 酵 母 菌 发 酵 生 产 hPI ，经 后 加 工 形 成 hI 。酵 母 系 统 下 游 后 加 工 比 细 菌表 达 系 统 简 单 ， 但 缺 点 是 生 产 慢 ， 生 产 周 期 长 ， 且 重 组 蛋 白 分 泌 量 少 (1 50 mg L) ，产 量 低 。因 此 ，虽 然 rhI 投 放 市 场 已 久 ，但 人 们 一 直 在 努 力 寻 求 和 探 索 更 加 有 效 的 表 达系 统 和 高 效 的 表 达 策 略 I2 J ，尤 其 是 对 ECO 一 尻 表 达 系 统 的 研 究 更 是 越 来 越 深 入 ，用E coli 系 统 表 达 hPI 的 策 略 也 越 来 越 多 。 另 一 方 面 ， 在 胰 岛 素 的 基 因 工 程 生 产 中 ， 下生物制药工艺与设备论文2 游 处 理 非 常 复 杂 ， 复 杂 的 下 游 处 理 极 大 地 降 低 了 胰 岛 素 的 最 终 收 率 。 本 研 究 围 绕 着 提高 重 组 目 的 蛋 白 表 达 量 ， 简 化 下 游 处 理 过 程 等 方 面 进 行 探 索 ， 建 立 了 一 套 经 过 优 化 的高 效 完 整 的 基 因 工 程 E coli 发 酵 表 达 ( His)6 一 Arg Arg 一 人 胰 岛 素 原 ( His)6 一 Arg Arg human proinsulin， PPh PI ， 后 加 工 成 hI 的 制 备 工 艺 。2 重组 人 工 胰岛 素的 生产 工艺 流 程2.1菌 种 的 制 备2.1.1目 的 基 因 的 提 取既 从 人 的 DNA中 提 取 胰 岛 素 基 因 ，可 使 用 限 制 性 内 切 酶 将 目 的 基 因 从 原 DN A 中分 离 。 主 要 有 如 下 4 种 方 法 ：（ 1）鸟 枪 法 ：用 一 大 堆 限 制 性 核 酸 内 切 酶 对 附 近 基 因 进 行 剪 切 ，再 提 取 所 需 要的 。 至 于 如 何 筛 选 ， 用 DNA 分 子 杂 交 ， 即 DN A 探 针（ 2）人 工 合 成 法：根 据 转 录 蛋 白 或 者 mRNA推 导 出 基 因 序 列 ，然 后 人 工 合 成 ，没 有 内 含 子 。（ 3） 从 基 因 文 库 中 提 取 ： 也 就 是 事 先 已 经 提 取 完 毕 的 拿 来 用（ 4） PCR 扩 增 技 术 ： 用 于 大 量 生 产 该 段 基 因 片 段 ， 用 于 商 业 化 运 作 。2.1.2提 取 质 粒使 用 细 胞 工 程 ,培 养 大 肠 杆 菌 ， 从 大 肠 杆 菌 的 细 胞 质 中 提 取 质 粒质 粒 为 环 状 。碱 裂 解 法 ：此 方 法 适 用 于 小 量 质 粒 DN A 的 提 取 ，提 取 的 质 粒 DN A 可 直接 用 于 酶 切 、 PCR 扩 增 、 银 染 序 列 分 析 。2.1.3基 因 重 组 将取 出 目 的 基 因 与 质 粒 ， 先 利 用 同 种 限 制 性 内 切 酶 将 质 粒 切 开 ， 再 使 用DN A 连 接酶 将 目 的 基 因 与 质 粒 “ 缝 合 ” ， 形 成 一 个 能 表 达 出 胰 岛 素 的 DN A 质 粒 。2.1.4将 质 粒 送 回 大 肠 杆 菌再 大 肠 杆 菌 的 培 养 液 中 加 入 含 有 Ca+ 的 物 质 ， 如 CaCl2, 这 使 细 胞 会 吸 收 外 源 基 因 ，此 时 将 重 组 的 质 粒 也 放 入 培 养 液 中 ， 大 肠 杆 菌 便 会 将 重 组 质 粒 吸 收 。将 大 肠 杆 菌 用 氯 化 钙 处 理 ， 以 增 大 大 肠 杆 菌 细 胞 壁 的 通 透 性 ， 使 含 有 目 的 基 因 的重 组 质 粒 能 够 进 入 受 体 细 胞 ， 此 时 的 细 胞 处 于 感 受 态 （ 理 化 方 法 诱 导 细 胞 ， 使 其 处 于最 适 摄 取 和 容 纳 外 来 DNA的 生 理 状 态 ） 。2.2胰 岛 素 的 产 生 和 精 制 （ 即 菌 种 的 发 酵 培 养 ）重 组 人 工 胰 岛 素 的 工 业 生 产 制 备 和 深 加 工 技 术 在 如 今 已 经 是 炉 火 纯 青 。 有 近 百 年的 发 酵 工 程 为 基 础 ， 结 合 现 在 的 基 因 工 程 技 术 的 产 物 ， 在 菌 种 制 备 后 的 发 酵 培 养 过 程更 是 可 靠 和 安 全 的 。发 酵 培 养 流 程 见 下 图 表 ：生物制药工艺与设备论文3 对从菌种库中取出的菌种进行活化及初步扩大培养在种子罐中对菌种进行进一步的扩大培养，至菌种到对数生长期时转入发酵罐培养分两阶段进行控制，第一阶段主要通过控制溶氧和补加甘油使菌体达到富集的目的，第二阶段通过补加甲醇使菌体进行高密度表达目的产物， HPLC 检测目的产物含量目的产物存在于发酵液上清中，此步骤主要控制目的产物收率通过两步柱层析，分别去除发酵上清液中的色素和杂蛋白利用紫外检测仪控制目的产物收率，主要试剂为乙醇与异丙醇调节 PH值，使 P1沉淀，再经离心干燥，得中间体I 固体控温进行转肽反应，主要试剂为DMSO与1,4-丁二醇再通过柱层析进行提纯，主要试剂为异丙醇调节 PH值，使 P2沉淀，再经离心干燥，得中间体II 固体通过控制湿度与温度进行脱帽反应，得到终产物胰岛素主要试剂为丙酮，产品为半固体经过两步柱层析对胰岛素进行提纯，试剂为Tris-HCl 和异丙醇通过超滤对提纯后的胰岛素进行浓缩，通过管道传递到下工序通过制备色谱对胰岛素粗品进行精制，主要试剂为色谱乙腈然后经两步结晶后通过管道过滤除菌到百级区对胰岛素成品进行一次结晶和水洗对水洗后的胰岛素进行过滤除菌后冻干，即得胰岛素成品发 酵 罐 培 养P2 纯 化过 滤 冻 干P2 沉 淀 、 干 燥脱 帽成 品 粗 纯 化成 品 精 纯 化P1 沉 淀 、 干 燥发 酵 液 固 液 分P1 纯 化菌 种 扩 培种 子 罐 培 养生物制药工艺与设备论文4 制 得 的 胰 岛 素 经 过 深 加 工 ， 可 以 得 到 片 剂 ， 注 射 剂 和 肺 部 吸 入 制 剂 等 。3 药物 检测这 种 重 组 人 工 胰 岛 素 的 检 测 重 点 应 该 是测 定 生 物 活 性效 价 测 定控 制 产 品 中 杂 质 潜 在 有 害 物 质保 证 产 品 安 全 性 和 有 效 性胰 岛 素 的 生 物 效 应 包 括 许 多 方 面 , 它 是 体 内 唯 一 能 降 低 血 糖 的 激 素 。 也 是 唯 一时 促 进 糖 原 、 脂 肪 、 蛋 白 质 合 成 的 激 素 。 胰 岛 素 的 主 要 靶 器 官 为 肝 脏 、 肌 肉 及 脂 肪 组织 , 它 控 制 着 三 大 营 养 物 质 糖 、蛋 白 质 、脂 肪 的 代 谢 和 贮 存 。 最 明 显 的 作 用 是 影 响糖 的 代 谢 , 降 低 血 糖 ,即 促 进 肝 脏 及 肌 肉 组 织 中 葡 萄 糖 的 利 用 , 激 活 糖 原 合 成 酶 和 丙 酮酸 脱 氢 酶 等 的 活 性 , 促 进 糖 原 的 合 成 并 抑 制 糖 原 的 分 解 。 此 外 , 对 肝 脏 来 说 还 有 抑 制蛋 白 质 分 解 的 作 用 ;在 肌 肉 组 织 中 促 进 +K 从 细 胞 外 向 细 胞 内 的 转 运 ;在 脂 肪 组 织 中 促 进氨 基 酸 由 细 胞 外 向 细 胞 内 转 运 ,促 进 脂 肪 的 合 成 ,抑 制 脂 肪 的 分 解 等 作 用 。 这 些 在 细 胞水 平 上 对 代 谢 系 统 的 作 用 是 基 于 胰 岛 素 与 其 受 体 的 结 合 得 以 实 现 的 。关 于 效 价 的 测 定 中 华 人 民 共 和 国 药 典 指 出 供 试 品 制 成 盐 酸 溶 液 ， 进 入 高 效 液相 色 谱 仪 进 行 色