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实验:噬菌斑的观察 一、 实验目的:观察噬菌体裂解细菌的现象。 烈性噬菌体能迅速裂解细菌,而温和性噬菌体由于原噬菌体基因 整合到寄主细胞的染色体基因组上,与寄主细胞同样分裂,并分配到 各个子细胞中去,因此在寄主细胞中找不到噬菌体的粒子,而是以形 成噬菌体的结构单元存在,称前噬菌体。这种噬菌体叫做温和性噬菌 体。这种含有温和性噬菌体的细胞称作溶原性细菌。 溶原性细菌可以自发地释放噬菌体,每1 代有 10 2105 细胞发 生裂解,释放出具有感染力的噬菌体。也可以通过诱异释放噬菌体。 已知具有诱异能力的物理、化学因素有紫外线、电离辐射、氮芥子气、 有机过氧化物、乙烯亚胺、丝裂霉素C 等。在布有敏感菌株的琼脂平 板上出现肉眼可见的噬菌斑。 一、 材料 1、菌种: E、colik12F2gal / gal +/ 带有噬菌体( )和缺陷型噬菌体(dgal ), 能发酵半乳糖。 E、cdi k12sgal - 不带噬菌体,不发酵半乳糖,对()噬菌体敏感。 2、培养基 (1) 肉汤培养基(液体):3ml/ 支3、9ml/ 支10、9ml/100ml 2 牛肉膏 5 克、蛋白胨 10 克、Nacl 5 克、蒸馏水1000ml、ph7. (2)肉汤固体培养基:120ml/250ml 1 肉汤培养基液加入2% 琼脂 (3)加倍肉汤培养基液 3ml/ 支2 成分相同,浓度加倍 (4)半固体培养基: 5ml/ 支10 肉汤培养基液中加入0.6 0.8%琼脂 3 、溶液: (1)加镁磷配缓冲液 10ml/ 支1、3ml/ 支2 KH2PO4 2 克、 K2HPO4 7 克、Mgso4.H2O 0.25 克、蒸馏水 1000ml (2)氯仿 4、器皿: (1)培养皿75mm 1块90mm 8块 (2)移液管 1ml 20支 10ml 2支 三、方法与步骤: 1 、噬菌体的诱导和裂解液的制备 (1)从供体菌 E、colik12F2gal 斜面挑取一环接种于 3ml 肉汤培养 基中,37培养 18 个小时。取 1ml 接种于 9ml 肉汤培养液中 (100ml )继续培养46 小时。取 9ml 培养液 3000r 、p、m离心,收集菌 体。用 5ml 加镁磷盐缓冲液洗涤一次。 (2)加入 3ml 含镁离子磷酸缓冲液制成细胞悬浮液,取3ml 于 7.5cm 培养皿中,在距40cm的 15w紫外灯下照射10 秒钟,加入加 倍肉汤 3ml,37下避光培养23 小时( 2hr15min) 。 (3)移入带塞的离心管中, 加入 0.4ml 氯仿,剧烈振荡 30-60 秒, 静止 5 分钟。 3500r 、p、m离心 15 分钟,收集上清液,此即为噬菌 体裂解液。 2、噬菌体效价的测定 (1) 从受体菌 E、colik12F2gal 斜面挑取一环接种于 3ml 肉汤培养基 中,37培养 18 小时,取 1ml 培养物加到9ml/100 150ml肉汤 培养基中,继续培养6 小时。 (2) 用肉汤培养基,将入噬菌体裂解液稀释成10 -6 、10 -7 、10 -8 三个 稀释度。 (3)分别取上述三个稀释度的噬菌体裂解液 0.5ml 加入到 5ml 半 固体肉汤琼脂中 ( 琼脂保温 48左右) ,每个稀释度2 支,然后迅速 加入受体菌培养物,每管0.2 0.3ml ,摇匀,迅速倒入已铺好肉汤 固体培养基底层的平皿中,制成双层37过夜培养,计算菌体的效 价。 3、噬菌体值 ( 噬菌体效价 ) 的计算 效价噬菌斑总数 / 噬菌体裂解液 (ml) 平板重复数稀释倍数 ( 单位/ 毫升) 例如:吸取稀释至10 万倍(10 -5) 的被检样品 0.1ml 测定三个培 养皿内的噬菌斑分别为220、230、240,其噬菌职为: 噬菌值 ( 单位/ 毫升) (220 230240)/3 0.1 10 5 2.3 10 8 噬菌斑是噬菌体的一种特性,使噬菌体浸染敏感细胞后,释放 子代噬菌体,通过琼脂扩散到四周细胞继续侵染引起细胞裂解而形 成的空斑。
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