还原糖含量测定条件探究生命科学学院2015/5/5 还原糖含量测定条件探究【摘要】 比较了两种DNS 试剂测定还原糖含量的影响因素。 探讨了试剂添加量、显色时间、测定波长以及显色后存放时间对测量结果的影响。结果表明，DNS 试剂的用量 1.5ml，沸水浴显色时间5min，显色定容 30min 后，分别在 540nm 波长条件下测定，数据的准确性和稳定性较好。【关键字】 DNS（3,5-二硝基水杨酸）还原糖比色法测量条件目前，测定还原糖含量的方法很多，3,3-二硝基水杨酸（ DNS）比色法是还原糖含量测定的一种常用方法。其具有简便、快速、灵敏度高等特点，但不同资料介绍的条件有很多差异，影响了测定结果的准确性和可比性1-5。本文对 DNS比色法测定条件进行探究， 讨论影响测量的关键因素， 使测量结果更具有准确性和可比性，为实际采用该方法提供参考。1 材料与方法1.1 材料与试剂3,5-二硝基水杨酸、氢氧化钠、丙三醇、苯酚、亚硫酸钠、酒石酸钾钠、葡萄糖、醋酸钠、冰乙酸，以上药品为分析纯。1.2 实验仪器SP-721E型可见分光光度计上海光谱仪器有限公司；Acculab 精密电子天平；702-型电热鼓风箱大连干燥箱厂；DZF-6050 型真空干燥箱上海博迅实业有限公司医疗设备厂； THZ-82A 水浴恒温振荡器江苏荣华仪器制造有限公司；80-2 离心机上海浦东物理光学仪器厂；HH-4 数显恒温水浴锅国华电器有限公司。1.3 实验方法1.3.1 DNS 试剂配制称取 3.25g 3,5-二硝基水杨酸溶于少量水中，移入500ml 容量瓶，加 2mol/L氢氧化钠溶液 162.5ml，再加入 22.5g 丙三醇，摇匀，定容至500ml，储存于棕色瓶放置在冰箱中待用3。称取 2.5g 3, 5 一二硝基水杨酸溶于少量水中，加入0. 5g 苯酚，再溶解0.075g亚硫酸钠、2. 5g氢氧化钠和 50g酒石酸钾钠，移入 500m1 容量瓶，摇匀，定容至 500m1，储存于棕色瓶放置在冰箱中待用。储存七天后使用4。1.3.2葡萄糖标准溶液的配置称取大于 1g 的葡萄糖置于热风干燥箱98干燥至恒重，准确称取1.000g 葡萄糖，用蒸馏水溶解并定容至1000ml。分别按表1 进行配置操作，充分混匀后于沸水浴中加热煮沸5min。 流水冲冷却后再分别向各试管中加入蒸馏水4ml，混匀。以管1 为空白对照， 540nm 波长下测各管的吸光度。绘制吸光度- 葡萄糖浓度曲线。表 1 葡萄糖标准溶液配置管号1 2 3 4 5 6 1mg/ml 葡萄糖溶液0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 DNS 试剂 2.02.02.0 2.02.02.0 1.3.3 DNS 测定波长的确定取 1.0ml 葡萄糖标准液及 1.0ml 蒸馏水分别置于 10ml 试管中，再各加 1.5ml DNS 试剂，沸水浴加热5min， 流水冷却，蒸馏水定容。将葡萄糖显色液- 水(空白)、DNS 试剂 - 水(空白)、葡萄糖显色液-DNS 试剂(空白)分别在波长 450600nm 范围内进行扫描。1.3.4 DNS 试剂用量及放置时间的确定在准确加入 1.0ml 葡萄糖标准溶液的系列10ml 试管中，分别加 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0ml 的 DNS 试剂，沸水浴加热5 m i n ，流水冷却、定容。以相同条件下不加葡萄糖标液作空白溶液，波长 540nm 下测定不同时间的吸光度。1.3.5加热时间的确定取葡萄糖标准液 1ml 及蒸馏水 1ml 于系列 10ml 试管中， 分别加入 D N S 试剂，置沸水浴中加热、反应1 、2 、3 、4 、5 、6 、7 、1 0 、1 5 、2 0 、2 5 、3 0 m i n 取出，流水冷却，定容。以相同条件下不加葡萄糖标液作空白溶液，在波长 540nm 下测不同加热时间时溶液的吸光度。1.3.6精密度实验取 5 支管分别加入 0.5ml 葡萄糖标准溶液和1.5mlDNS 试剂，混匀并作空白，沸水浴加热5min，流水冷却、定容。以相同条件下不加葡萄糖标液作空白溶液，波长540nm 下测定吸光度。2 结果与分析2.1 绘制吸光度- 葡萄糖浓度曲线。结果如图 1 所示：0.00.20.40.60.81.00.00.20.40.60.81.01.2(1)(2)ODmg/mlModelPolynomiAdj. R-Squa0.996780.9994ValueStandard ErD1Intercept-0.0020.00485D1B10.31470.008BIntercept-0.0080.00756BB11.1740.01249图 1、540nm 波长下葡萄糖的标准曲线2.2 DNS 测定波长的确定DNS 即二硝基水杨酸法是利用碱性条件下，二硝基水杨酸（DNS）与还原糖发生氧化还原反应，生成3-氨基-5-硝基水杨酸，该产物在煮沸条件下显棕红色，且在一定浓度范围内颜色深浅与还原糖含量成比例关系的原理，用比色法测定还原糖含量的。关于DNS 测量还原糖含量的波长，不同文献有不同的记载：分别有 482-484、490、520、540 等6-9。为了进一步探究其测量的最适波长，考虑相关因素进行波谱扫描，结果如图2 所示：440460480500520540560580600620-0.20.00.20.40.60.81.01.21.41.61.8ODG+HH+DG+DDNS 试剂 1 的波长扫描2.3 DNS 加热时间的确定随着沸水浴加热时间的延长， 吸光度变大，但两种试剂均在5min 之后吸光度基本不变，说明显色反应基本完成，吸光度较稳定。故D N S 试剂水浴加热时间在 5min 即可，结果如图 3 所示：02468101214160.20.30.40.50.60.70.8ODTime(2)(1)图 3、DNS 试剂加热时间对测定结果的影响2.4 DNS 试剂用量及放置时间的确定DNS 试剂的用量与加热后放置的时间长短对测量结果也会造成一定的影响，本文通过改变试剂用量和加热后放置时间，来确定最适宜的试剂用量与放置时间，如图 4 与图 5 所示：510152025300.320.340.360.380.400.420.44ODTime(0.5)(1.0)(1.5)(2.0)(2.5)(3.0)图 4、试剂 1 放置时间及用量对吸光度的影响510152025300.300.350.400.450.500.55ODTime(0.5)(1.0)(1.5)(2.0)(2.5)(3.0)图 5、试剂 2 放置时间及用量对吸光度的影响2.5 精密度实验表 2、试剂 1 精密度实验管号1 2 3 4 5 吸光度0.157 0.158 0.157 0.156 0.156 平均值： 0.1568 标准差 0.000837 表 3、试剂 2 精密度实验管号1 2 3 4 5 吸光度0.560 0.600 0.530 0.570 0.550 平均值：0.562 标准差： 0.025884 3 讨论在实验过程中， 显色之前空白和待测液中DNS 试剂的添加量是相同的， 但显色期间由于部分DNS 试剂与待测液中还原糖相结合，从而造成测定吸光度时，空白中 DNS 试剂含量大于待测液中DNS 试剂含量。从图 1 可知，最大吸收峰处的波长为500nm。一般情况下，选取最大吸收峰处的波长进行测定可以提高灵敏度，但由图 1 可知，在此波长下 DNS 试剂也具有一定的吸光度(DNS 试剂- 水曲线 )。再者，实验过程中，显色之前空白和待测液中DNS 试剂的添加量是相同的，但显色期间由于部分DNS 试剂与待测液中还原糖相结合，从而造成测定吸光度时，空白中DNS 试剂含量大于待测液中DNS 试剂含量。故500nm 下，DNS 试剂对测定结果干扰严重。结合葡萄糖显色液- 水曲线可以看出，这种影响在 540nm 的情况下一直很显著。故本实验DNS 试剂 1 最终确定的测定波长选为540nm，而不是 500nm(最大吸收波长 )。两种 DNS 试剂基本都是在加热五分钟后， 反应基本完成，吸光度比较稳定，故为了提高实验效率，我们在实验中可采取加热五分钟进行实验。由图 4、5 可知，试剂用量和放置时间与吸光度值的关系，当DNS 试剂用量小于 1.5ml 时， 溶液吸光度随 DNS 试剂用量的增加而增大， 试剂用量在 1.52ml 时，放置 20min 后试剂 2 的吸光度值较稳定，而试剂一的吸光度则呈现先减小后增大的趋势。 造成该现象的原因， 可能是冷却时间不够， 造成显色不够稳定。在实际测定中， 两种试剂均可以采用1.5ml， 建议试剂 1 的显色时间为 30min而试剂 2 的显色时间为 30min。从精密度实验来看，在本实验条件下试剂1 的精密度大于试剂2。4.结论在碱性溶液中 3,5-二硝基水杨酸被还原糖还原生成的氨基化合物在500nm 波长下具有最大吸收。但在此波长下D N S 试剂具有一定的吸光度，对测定结果干扰严重，故DNS 法测定还原糖含量最佳条件为DNS 试剂用量 1.5-2ml、沸水浴中保持 5min、定容后放置 30min 后测量，检测波长为540nm。【参考文献】：1杨贵明，蒋爱华，薛秋生 .用 DNS 光度法测定还原糖的条件研究J 安徽农业科学 2006，34（14） ：3258-3264 2陈齐英，孙雪奇，徐晓霞 . 3，5- 二硝基水杨酸比色法测定亮菌口服液中多糖的含量 J.华西药学杂志， 2000，1（53） ：193- 194. 3宁正祥 . 食品成分分析手册 M. 北京: 中国轻工业出版社 ,1998. 4中华人民共和国商业标准SB/T1007792 挂面生产工艺技术规程5郑远斌 , 吴锦忠 . DNS 比色法测定莲子中多种糖的含量J. 福建中医学院学报,2004，14（4） ：32-35. 6宋占午，王莱，刘艳玲 . 3,5-二硝基水杨酸测定还原糖含量的条件探讨J. 西北师范大学学报（自然版）1997，33（2） ：52-54 7孙伟伟 , 曹维强 , 王静. DNS法测定玉米秸秆中总糖 J. 食品研究与开发，2006（6） ：120-124 8王俊丽 ,聂国兴 ,李素贞等， DNS 法测定还原糖含量时最适波长的确定J 河南农业科学， 2010（4） ：115-118 9赵凯，许鹏举，谷广烨 .3,5-二硝基水杨酸比色法测定还原糖含量的研究J 食品科学， 2008（08） ：534-536 【附】马铃薯中还原糖含量测定实验报告马铃薯中还原糖含量测定实验报告实验原理：在氢氧化钠和丙三醇存在下，DNS 与还原糖共热后被生成氨基化合物。再过量的氢氧化钠碱性溶液中此化合物呈桔红色，在540nm 波长处有最大吸收值， 在一定的浓度范围内， 还原糖的量与吸光值呈线性关系，利用比色法可测样品中的含糖量。实验材料：马铃薯块药品：葡萄糖（需 98烘干至恒重） 3, 5 一二硝基水杨酸、苯酚、亚硫酸钠、氢氧化钠、酒石酸钾钠仪器：离心机、 10ml 离心管、水浴锅、大号研钵、分光光度计、容量瓶、烘箱实验方法：样品的处理：马铃薯去皮，称5g 加水 10ml 捣碎，倒入烧杯， 50水浴加热20min，边加热边震荡， 12000r/min 离心十分钟，取上清液。 （崔辉梅，马铃薯含量测定方法的比较 2006）DNS 配制：称取 2.5g 3, 5一二硝基水杨酸溶于少量水中，加入0. 5g 苯酚，再溶解 0.075g 亚硫酸钠、 2. 5g氢氧化钠和 50g 酒石酸钾钠，移入500m1容量瓶，摇匀，定容至500m1 ，储存于棕色瓶放置在冰箱中待用。储存七天后使用（中华人民共和国商业标准SB/T10077-92）葡萄糖标准溶液的配制：称取大于 1g 的葡萄糖置于热风干燥箱98干燥至恒重，准确称取1.000g