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脑缺血再灌注损伤大鼠重要脏器钙调神经 磷酸酶活性变化及阿司匹林 作者:邱丽颖 杨志勇 杜斌 范红斌 李英 王晓岚 程建青【摘要】 目的 观察脑缺血再灌注(CIR)损伤时脑、心和肾组织钙 调神经磷酸酶(CaN)活性变化。方法 线栓法制作局部脑缺血 2 h,再 灌注 24、48 和 72 h 模型,生化法测定脑、心和肾组织 CaN 活性, 并观察 60 kg/mg 阿司匹林(ASA)对其影响。结果 再灌注 24 h 时, 模型组与假手术组脑组织及肾组织的 CaN 活性无显著差异。模型组 心脏的 CaN 活性明显低于假手术组。ASA 对脑和肾的 CaN 活性无 明显影响,但使心 CaN 活性于正常水平。再灌注 48 h 时,脑和肾组 织明显升高,均与其各自假手术组有显著差异。心脏 CaN 活性仍低 于其假手术组,但与 24 h 模型组无显著差异。再灌注 72 h 时,脑 CaN 活性进一步升高,与其假手术组、24 和 48 h 均有显著差异;心 CaN 活性恢复至正常水平;肾 CaN 活性仍维持在 48 h 时的较高水平。 ASA 使脑和肾的 CaN 活性维持在正常水平,对心 CaN 活性无明显 影响。结论 脑缺血再灌注时,不同组织 CaN 活性变化不同,这 可能与在应激过程中不同器官磷酸化反应不同有关。ASA 在维持其 稳定中有重要作用。 【关键词】 脑缺血再灌注;重要脏器;钙调神经磷酸酶;大鼠;阿司 匹林钙调神经磷酸酶(CaN)是迄今发现的惟一受 Ca2+/CaM 调节的丝/ 苏氨酸蛋白磷酸酶。目前认为其是一种分布广泛、参与多种细胞功 能调节的多功能信号酶1,最近在信号转导及细胞凋亡方面的作 用有新的研究报道2,3。CaN 在多种疾病中的表现及意义也引 起重视。有研究表明,不同状态下,大鼠不同器官 CaN 活性表现不 同,并认为其可能对不同器官功能的调节有重要意义46。本 文将进一步探讨大鼠脑缺血再灌注(CIR) 24、48 及 72 h 时脑、心和 肾器官 CaN 活性变化特征及阿司匹林(ASA)对其影响。1 材料与方法1.1 药品和试剂 ASA 为 Sigma 公司产品,生化试剂盒购自南 京建成生物工程研究所,环孢素 A 粉(CsA)及其余试剂均为国产分 析纯。1.2 动物及实验分组 雄性 SD 大鼠,体重 240290 g,中国 科学院上海动物实验中心提供。术前 12 h 禁食,自由饮水。再灌注 24、48 和 72 h 3 个时段均随机分成假手术组,缺血再灌注模型组。 再灌注 24 和 72 h CsA 和 ASA 治疗组。1.3 模型制备 用直径 0.205 mm 尼龙线作栓子,参考邱丽颖7法制作右侧大脑中动脉栓塞模型。假手术组除不插入栓子,其 余相同。缺血 2 h 麻醉状态下拨出线栓行再灌 24、48 和 72 h。1.4 CaN 活性测定 按试剂盒说明制备脑、心和肾的组织样本, 无机磷法测定 CaN 活性,以每小时每毫克蛋白的 CaN 分解底物对 硝基苯磷酸(PNPP)产生 1 mol/L 无机磷的量为一个活力单位。考马 斯亮蓝法测定组织蛋白含量。1.5 统计学处理 SPSS11.0 统计软件进行数据处理,实验数据 以 xs 表示,组间行单因素方差分析,两两比较 q 检验。2 结 果2.1 CIR 不同时间点脑、心、肾重要器官 CaN 活性变化 CIR 24、48 和 72 h 3 个假手术组间脑组织 CaN 活性均无显著差异。模型 组 CIR 24 h 时,脑组织 CaN 活性与假手术组无显著差异,CIR 48 h 时,其活性明显升高,与其假手术组和 CIR 24 h 组均有显著差异 (P0.01)。CIR 72 h 时,其活性进一步升高,明显高于其假手术组、 CIR 24 和 48 h 组(P0.01),见表 1。CIR 24、48 和 72 h 3 个假手 术组间心脏组织 CaN 活性均无显著差异。模型组 CIR 24 h 时,心脏 组织 CaN 活性降低,明显低于其假手术组(P0.01),CIR 48 h 时, 维持在较低水平,与 CIR 24 h 组无显著差异。CIR 72 h 时,其活性 恢复至正常,与其假手术组无显著差异,见表 1。CIR 24、48 和 72 h 3 个假手术组间肾组织 CaN 活性均无显著差异。模型组 CIR 24 h 时,肾组织 CaN 活性与假手术组无显著差异,CIR 48 h 时,其活性 明显升高,与其假手术组和 CIR 24 h 组均有显著差异(P0.01)。 CIR 72 h 时,其活性维持在 48 h 时的高水平状态,明显高于其假手 术组和 CIR 24 h 组,见表 1。表 1 大鼠脑 CIR 重要器官 CaN 活性 变化与假手术组比较:1)P0.01 ;与 24 h 模型组比较:2)P0.01;与 48 h 模型组比较:3)P0.012.2 ASA 和 CsA 对 CIR 时 CaN 活性的影响 模型组 CIR 24 h 时,脑组织 CaN 活性与假手术组无显著差异,CsA 抑制其活性,与 其假手术组和模型组均有显著差异(P0.01)。ASA 对其活性无明 显影响。CIR 72 h 时,其活性明显升高(P0.01),CsA 抑制其活性 (P0.01),但明显高于其假手术组。ASA 使 CaN 活性维持在正常 水平,与假手术组无显著差异,见表 2。模型组 CIR 24 h 时,心脏组 织 CaN 活性下降,明显低于其假手术组,CsA 抑制其活性(P0.01), 与其模型组无显著差异。ASA 对其活性无明显影响。CIR 72 h 时, 其活性恢复至正常水平,CsA 仍抑制其活性,明显低于其假手术和 模型组(均 P0.01)。ASA 使 CaN 活性维持在正常水平,与假手术 组无显著差异,见表 2。模型组 CIR 24 h 时,肾组织 CaN 活性与假 手术组无显著差异,CsA 升高其活性,与其假手术组和模型组均有显著差异(均 P0.01)。ASA 对其活性无明显影响。CIR 72 h 时, 其活性升高,CsA 对其升高的活性无明显抑制作用,明显高于其假 手术组(P0.01)。ASA 使 CaN 活性维持在正常水平,与假手术组 无显著差异,见表 2。表 2 ASA 和 CsA 对大鼠脑 CIR 时 CaN 活性 影响与假手术组比较:1)P0.01;与模型组比较: 2)P0.01 ;与 CsA 组比较:3)P0.013 讨 论CaN 在脑缺血中作用和重要地位早已引起重视。阎力君等 8报道,小鼠断头 5 min 后,胞浆 CaN 内源性底物的磷酸化水平 明显降低,CaN 参与了缺血后脑内蛋白磷酸化过程的调控。 Nagahiro 等提出,迟发性神经元死亡与 Ca2+/CaM 依赖的蛋白激酶 和蛋白磷酸酶的作用失衡有关9。Arono 等认为可能与某些内源 性因子有关,其研究发现 CaN 结合蛋白 cain/cabin1 是内源性 CaN 抑制因子,其活性受 Ca2+、半胱氨酸蛋白酶 Calpain 的调节14。 本研究发现,CIR 不同时期,重要脏器 CaN 活性表现出不一致的变 化特征。这些不一致的改变可能与在 CIR 这一全身性应激反应引起 的磷酸化反应不同有关,也可能与全身神经体液调节或自身磷酸化 代谢特点有关。CsA 作为 CaN 特异性抑制剂,对心、脑、肾再灌注损伤的保 护作用已多有研究1517。ASA 对 CIR 时脑保护作用也有报道, 但它们对 CIR 时远隔器官的 CaN 活性影响少见报道。本研究发现, CIR 24 h 时,CsA 明显抑制脑和心的 CaN 活性,却升高了肾的 CaN 活性,这也可能是 CsA 引起肾脏毒性的原因之一18。ASA 使脑、 心、肾 CaN 活性均维持在正常水平。表明 CIR 时 ASA 在维持 CaN 活性稳定方面有重要作用,在维持重要器官磷酸化反应平衡中有重 要意义。综上所述,CIR 不同时间点重要器官 CaN 活性呈现不一致的 变化特征,可能与不同脏器对 CIR 应激反应不同有关。ASA 可维持 不同状态下 CaN 活性的稳定,其详尽机制有待研究。【
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