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第十一章,抗生素类药物的分析,第一节 概述,抗生素的定义,抗生素的来源,1. 生物合成(发酵),2. 化学合成或半合成,是指“在低浓度情况下对某些生物的生命活动有特异性抑制作用一类化学物质的总称”,抗生素质量的复杂性,化学纯度低,同系物多 异构体多 降解物多,发酵过程不易控制 易受污染,工艺复杂,活性组分易发生变异,产品稳定性差,分子结构大多不稳定,降解后疗效下降、失效或增加毒副作用,抗生素类药物的质量分析,(一)鉴别试验 1、显色反应特殊基团的反应 2、光谱法特征吸收 3、色谱法保留行为 4、生物学方法抗菌能力,(二)检查,1、常规检查水份、酸碱度等 2、有机和无机杂质检查 3、异常物质的检查异常毒性、热原等 4、其他检查其他共存组分,含量测定或效价测定,1、微生物检定法 稀释法 比浊法 管碟琼脂扩散法抑菌圈 灵敏度高、需用量少 适用范围广纯品、不纯品、已知的和新的 可一次测定同类型抗生素的总效价无需分离纯化 与临床的应用要求一致 操作繁琐、费时费力 误差较大,效价:是指每ml或每mg中含有某种抗生素有效成分的多少,是以抗生素对微生物的杀伤或抑制程度为指标来判断效价的一种方法,是结构复杂和多组分抗生素效价测定的首先方法,2、物理化学法HPLC LC-MS UV 容量法 准确可靠、专属性高、操作简单、省时、样品用量少,1、对结构已知或提纯的抗生素 2、需要标准品对照,仪器分析方法,分类(按结构与性质):内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、大环内酯类、氯霉素类、多肽类、抗肿瘤类林可霉素类、其他抗生素类,第二节 内酰胺类抗生素,青霉素类,一、结构与性质,A,B,头孢菌素类,A,B,青霉素,(青霉素G、苄青霉素),氨苄西林 (氨苄青霉素),阿莫西林 (羟氨苄青霉素),普鲁卡因青霉素,头孢氨苄,头孢拉定,头孢噻吩钠,头孢羟氨苄,酸性,性质,与碱金属(Na+、K+)成盐,(一)羧基,易溶于水,与有机碱(普鲁卡因)成盐,难溶于水,普鲁卡因青霉素,(二)手性C,(5%头孢唑啉钠溶液 1824),头孢菌素类 C6 C7,青霉素类 C3 C5 C6,旋光性,(三),青霉素类 母核无明显UV多数有苯环取代基,UV,青霉素钠,头孢氨苄,(四)内酰胺环 的不稳定性,水溶液 不稳定,干燥纯净 稳定,不稳定性因素,四元环张力大,酰胺键易水解,青霉素的降解途径,与含水量和纯度密切相关,青霉素的降解产物 青霉素酶青霉噻唑酸 强酸性环境青霉酸 弱酸性环境青霉烯酸 强酸性-加热青霉醛 强酸性-加热/青霉素酶-重金属青霉胺,二、,鉴别,(二)呈色反应,1. 羟肟酸铁反应,-内酰胺类,NaOH,呈色,头孢菌素类,3. 茚三酮反应,-氨基,4. 双缩脲反应,-内酰胺类,(开环分解),似肽键,5. 与变色酸-硫酸反应,活泼“-CH2-”,青霉素 阿莫西林 氨苄西林,(分解),变色酸,显色,6. 与重氮苯磺酸反应,(偶合),酚羟基,头孢哌酮,7. 与铜盐反应,橄榄绿色,NaOH,专属反应,(三)沉淀反应,1. 遇酸,在过量HCl或 有机溶剂中溶解,青霉素的碱金属盐的溶解性,2. 有机胺盐反应,(1)重氮化 - 偶合反应,重氮化-偶合反应,芳伯氨基,普鲁卡因,普鲁卡因青霉素,(2)与三硝基苯酚反应,二苄基乙二胺,样品、分解产物,头孢氨苄 max = 262nm,青霉素V钠 A280nm/A264nm = 1.301.50,-内酰胺环,酰胺,利用不同结构的原子核在D2O中有 不同的NMR光谱进行鉴别,JP,以吸收峰频率对峰强度进行作图,主要研究原子核的磁化性质及其在 外磁场中的运动规律,对照品对照法,三、杂质检查,药物 检查项目 检查方法 头孢他啶 聚合物 HPLC法 头孢曲松钠 头孢哌酮钠 头孢噻肟钠 头孢呋辛酯 有关物质和异构体 HPLC法 头孢氨苄 有关物质 反相TLC法 青霉素钾(钠) 吸收度 紫外分光光度法,1.头孢他啶聚合物的测定 固定相:葡聚糖凝胶G-10( 40120m ) 流动相A:3.5%硫酸铵的0.01mol/L磷酸盐缓冲液 流动相B:水对照品溶液:头孢他啶对照品 100g/ml,1)系统适用性试验:理论塔板数和拖尾因子用0.1mg/ml蓝色葡聚糖2000、流动相A测定;重复性用对照品溶液、流动相B测定。 N不低于900,拖尾因子0.751.5,峰面积的RSD应小于5.0%。 2)测定方法 进样供试液,用流动相A;进样对照液,用流动相B。以外标法计算,含头孢他啶聚合物以头孢他啶计不得超过0.3%。,2.头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查 固定相:ODS 流动相:0.2mol/L磷酸二氢铵-甲醇(62:38) 1)头孢呋辛酯2-异构体的制备:头孢呋辛酯对照品+流动相 头孢呋辛酯2-异构体。 2)系统适用性试验:各异构体之间的R1.5,以 头孢呋辛酯A异构体计算n1500。,3)异构体: 相对保留时间 1-被测物 2-标准物 异构体 相对保留时间 判断 B异构体 0.85 供试液谱图中A异构体的峰面积 A异构体 1.0 与A、B异构体峰面积和之比应为0.480.55。,异构体A,异构体B,头孢呋辛,3.头孢氨苄中有关物质的检查-反相TLC法 固定相:活化后的硅胶G板置5%(V/V)正十四 烷的正己烷溶液中,展至顶部,凉干 展开剂:0.1mol/L枸橼酸-0.2mol/L磷酸氢二钠-丙酮(120:80:3) 供试液:本品 50mg/ml 对照液(1):本品 0.5 mg/ml 对照液(2):-苯甘氨酸 0.5 mg/ml 对照液(3):7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸 0.5 mg/ml,结果判断:供试液如显杂质斑点,与对照液(2)(3)位置相同上所的斑点比较,其颜色不得更深;如显其他杂质斑 点,与对照液(1)所显的主斑点比较,其颜色不得更深。,4.青霉素钠(钾)的吸收度检查: 供试液 1.80mg/ml, 结果判断:A280不得大于0.10,HPLC、碘量法、汞量法、酸碱滴定法、可见紫外分光光度法等,(水解),水解产物,定量过量,剩余,-内酰胺类,反应分两步进行: 1. 水解反应 (按化学计算量进行) 2. 氧化-还原反应 (无固定的量关系,受温度、PH值和时间等因素影响,应严格控制反应条件并采用标准品平行对照测定),例,注射用普鲁卡因青霉素 含量测定,取装量差异项下的内容物,精密称 取约0.12g,置100ml量瓶中,加水使溶 解并稀释至刻度,摇匀,精密量取5ml, 置碘瓶中,加1mol/L氢氧化钠溶液1ml 放置20分钟,再加1mol/L盐酸溶液1ml 与醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4.5)5ml,精密 加入碘滴定液(0.01mol/L)15ml,密塞, 摇匀,在2025暗处放置20分钟,用 硫代硫酸钠滴定液(0.01mol/L)滴定,,至近终点时加淀粉指示液,继续滴定并 强力振摇,至蓝色消失;另精密量取供 试品溶液5ml,置碘瓶中,加醋酸-醋酸 钠缓冲液(pH4.5)5ml,精密加入碘滴 定液(0.01mol/L)15ml,密塞,摇匀, 在暗处放置20分钟,用硫代硫酸钠滴定 液(0.01mol/L)滴定,作为空白。同时 用青霉素钠对照品同法测定作对照,算 出供试品的含量。,V样空,V样,V对空,V对,空白试验,A、消除样品已降解产物的干扰 B、消除样品中其他消耗碘的杂质的干扰 C、消除碘挥发造成的误差,以未经水解的样品作空白测定,空白,样品,Na2S2O3,采用标准品平行对照测定,A、可消除温度、pH、操作、环境等条件的影响 B、使本法测定结果与微生物检定法一致,(1)弱酸性 pH4.5,碱 I2 IO3- + I-,酸 普鲁卡因与碘在酸性条件下会产生复盐沉淀,(2)温度 2426,温度38 未水解的供试品亦消耗碘,(3)水解时间,以水解20分钟后的耗碘量最大,(4)反应时间,反应20分钟后,耗碘量随时间的 变化较小,可减小含量测定的误 差,(1)灵敏度高,样品 : 碘 = 1 : 8,(2)反应条件、实验操作要求高,加试剂次序、反应时间、滴定速度相同,原料,(水解),青霉素族,碱性水解产物青霉噻唑酸,进一步水解产物青霉胺,样 品,以未经水解的样品作空白测定,例,青霉素钠 含量测定,取本品约50mg,精密称定,加水 5ml溶解后,加1mol/L氢氧化钠溶液5ml ,摇匀,放置15分钟,加1mol/L硝酸溶 液5ml,醋酸盐缓冲液(pH4.6)20ml及水 20ml,摇匀,照电位滴定法(附录 A), 用铂电极为指示电极,汞-硫酸亚汞电极 为参比电极,在3540,用硝酸汞滴 定液(0.02mol/L)缓慢滴定,,(控制滴定过程约为15分钟),不计第 一个等当点,计算第二个等当点时消耗 滴定液的量。每1ml硝酸汞滴定液(0.02 mol/L)相当于7.128mg的总青霉素(按 C16H17N2NaO4S计算)。 另取本品约0.5g,精密称定,加水 与上述醋酸盐缓冲液各25ml,振摇使完 全溶解,在室温下,立即用硝酸汞滴定 液(0.02mol/L)滴定,终点判断方法同上.,每1ml硝酸汞滴定液(0.02mol/L)相当于7.128mg的降解物(按C16H17N2NaO4S计算)。总青霉素的百分含量与降解物的百分含量之差值即为青霉素的含量。,(1)以第二次滴定突跃为终点电位法指示终点,(2)反应摩尔比 1 : 1,(3)空白试验 消除已降解产物干扰,(4)优点 不需标准品,精密称取含水量为0.5%的青霉素 钠0.0502g,按药典方法测定总青霉素含 量时,用去硝酸汞滴定液(0.02009mol/L) 6.97ml。另精密称取上述样品0.5013g, 按药典方法测定降解物含量时,用去硝 酸汞滴定液(0.02009mol/L)1.33ml。以干 燥品计算,求样品中青霉素的含量。,例,青霉素钠 含量测定,(钠盐),-内酰胺类,-内酰胺环的不稳定性,中和,加NaOH中和,(1)水解前先中和溶剂和样品,(2)加热时避免吸收CO2,不能使酚酞变红,(3)空白试验校正(消除Na2CO3干扰),(四)可见-紫外分光光度法,原理:利用青霉素的降解产物青霉烯酸在320 nm360 nm处有强烈吸收特性,并且该降解产物与Cu2+或Hg2+形成稳定并易于测定的配位化合物,从紫外分光光度法测定。 硫醇汞盐法 酸水解铜盐法 羟肟酸比色法,(水解),(1)原理,稳定剂,JP,青霉素族,酸性降解产物,(2)方法,H+ ,(3)特点,实验条件随各药物稳定性不同而定,标准品对照法,(1)原理,(咪唑),青霉素族,催化剂,(2)方法,对照品法,pH 9,(3)讨论,a. 咪唑催化的水解产率高,硫醇汞盐稳定(3h),b. 侧链有-NH2时,需加醋酐先将其乙酰化后才能发生上述反应,(4)特点,A、简便快速 B、用标准品对照,重现性良好,RSD1%,红色,-内酰胺类,特点 快速、高效、灵敏专属性强、重现性好一法多用(鉴别、检查、含测),
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