本本 科科 生生 毕毕 业业 设设 计计 (论论 文文)题目：乐至黑山羊乳上皮黏蛋白题目：乐至黑山羊乳上皮黏蛋白 MUC1 蛋白蛋白 和基因的多态性研究和基因的多态性研究教学单位教学单位 _生命科学与技术学院生命科学与技术学院_ 姓姓 名名 ? 学学 号号 200731301001 年年 级级 2007 级级 专专 业业 生物技术生物技术 指导教师指导教师 ? 职职 称称 教授教授 2011 年年 5 月月 12 日日1目目 录录前 言31 材料与方法41.1 试验山羊41.2 主要仪器41.3 主要试剂41.4 乳蛋白 MUC1 多态性的分析51.5 乳 MUC1 基因多态性的 PCR 检测62 结果83 讨论9参考文献11致 谢132乐至黑山羊乳上皮黏蛋白乐至黑山羊乳上皮黏蛋白 MUC1 蛋白和基因蛋白和基因 的遗传多态性研究的遗传多态性研究?（?生命科学与技术学院，成都 610041）摘要：摘要：本实验采用 SDS-PAGE 及 PCR 扩增法分析山羊乳 MUC1 及其基因的多态性。结果显示，乐至黑山羊乳 MUC1 在 SDS-PAGE 上呈现出多态性，表现为1 条或 2 条迁移率不同的区带，并且用 PCR 方法扩增出乐至黑山羊乳 MUC1 不同大小(1700 到 3500bp)的基因片段。在 35 个样品中共检测到 7 种基因型和 6个等位基因，即 A、B、C、D、E、F，编码的蛋白质分子量范围为217250ku，明显高于普通乳牛。关键词：关键词：乐至黑山羊；乳 MUC1；遗传多态性Research on Genetic Polymorphism of Milk Epithelial MUC1 of Lezhi Black Goat at Protein and Gene LevelXiao Kui(College of Life Science and Technology, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, China)Abstract: Genetic polymorphisms of Lezhi black goat milk mucin, MUC1, were assayed by SDS-PAGE and PCR methods. Lezhi black goat milk MUC1 exhibited genetic polymorphisms, showing one or two different bands on SDS-PAGE. Gene fragments of MUC1 from 1700 to 3500bp were amplified by PCR. Seven genotypes and six alleles (A, B, C, D, E, and F) were detected in 35 samples. The encoding protein molecular weight ranges from 217 to 250ku, significantly higher than those of cattle. Key words: Lezhi black goat; milk MUC1; genetic polymorphism3前前 言言国内外对乳上皮黏蛋白（MUC1）的研究是近年来的热点，现有对人、奶牛、牦牛1-5等乳 MUC1 的研究报道。对于人类研究方面有胃癌组织中粘蛋白的表达及其临床意义2、MUC1 与人乳腺癌细胞粘附能力关系的体外研究6、青年与中老食管癌组织中 RAR 蛋白和 MUC1 蛋白表达7等。在奶牛以及牦牛方面主要是对牛乳中上皮粘蛋白 MUC1 的遗传多态性进行研究。MUC1 黏蛋白是一种高糖化(糖化大于 50%)、高分子量(200103Da)的糖蛋白，因其 cDNA 在目前已知的 9 种黏蛋白中第一个被克隆而得名8。MUC1 是跨膜分子，其跨膜序列如棒状插入细胞膜，并有一个由 69 个氨基酸残基组成的尾延伸到细胞质中。MUC1 有一相对大的细胞外区域，由 10002200 个氨基酸残基组成，包括 VNTR(Variable Number of Tandem Repeats，可变串联重复序列)区9。细胞外区域长约 200500nm，比存在于细胞膜外的多糖-蛋白复合物(10nm)高出很多。VNTR 富含 O-糖基化位点10、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和脯氨酸(P)残基。MUC1 的表达有组织特异性，主要表达于乳腺等上皮组织。MUC1 主要存在于某些上皮性组织和器官中，如乳腺、胰腺、卵巢等。在乳分泌过程中，乳脂以脂肪球的形式通过顶浆分泌进入腺泡腔，MUC1 也随着包裹在脂肪球上的上皮细胞顶膜一同进入乳中，并主要分布在乳脂肪球膜上。MUC1 在正常上皮组织中起重要保护作用。在肿瘤细胞中具有促使肿瘤细胞对正常细胞的粘附作用和减少肿瘤细胞间的粘附力，并且通过位阻现象使肿瘤细胞逃避免疫识别等作用。具体功能包括如下方面：由于 MUC1 可在粘膜表面产生润滑作用，对粘膜表面有一定的物理保护作用；乳汁中，HMFG 中的粘蛋白可在消化系统中稳定脂肪乳浊液，直到脂肪被水解；在膀胱上皮、汗腺上皮和乳腺上皮等中，粘蛋白可在一定范围内抵抗 pH 值变化和摩尔渗透压浓度变化所造成的影响；粘蛋白的糖侧链可束缚病原性细菌，从而阻止了它们接近细胞膜。有研究表明 MUC1 能与大肠杆菌结合。已知 MUC1 上至少有唾液酰 22，32 半乳糖苷基是与细菌结合相关的结构；粘蛋白可隐蔽中性粒细胞、NK 细胞和毒性 T 细胞的毒性；由于粘蛋白的独特结构，它们还有一定的抗粘性。如基于 VNTR 的数目不同，粘蛋白膜外区域的长度可从 10002200个氨基酸残基之间变动。一个延伸的 O-糖基化的 28 个氨基酸残基约有 7nm 长，所以 MUC1 的粘蛋白状区域可伸展出细胞膜表面至少 200500nm，比其他的膜外结合蛋白都要高。有研究发现，转染了 MUC1 基因的细胞的聚集能力比没有转染 MUC1 基因的细胞要低。故有可能细胞表面高浓度的 MUC1 阻止了细胞间的粘附。而且在有唾液酸存在时，由于产生大量的强负电荷可使这个作用增4强10-11。目前 MUC1 主要应用于诊断、治疗乳腺癌以及疫苗合成方面。MUC1 分子高度糖基化以及分子中富含脯氨酸的特点，使其在上皮细胞的表面呈伸展的细丝状，而其分子中含有的大量的唾液酸成分使上皮细胞表面带有强的负电荷12。鉴于此，研究人员认为，MUC1 在上皮细胞表面可能在保证导管和腺泡处于开放状态、防止细胞粘连(与肿瘤发生有关)、阻止病原微生物人侵方面有作用13-14；Hens 等对荷斯坦牛的研究表明，乳 MUC1 分子量大的个体其乳脂、乳蛋白的含量及产量高15；另外，MUC1 在人和动植物方面的作用近年来也引起了人们的关注16。对多种动物乳的 MUC1 研究显示，其具有特殊的遗传多态性。目前，已研究过的物种中除小鼠外，人、奶牛、马、豚鼠等动物乳 MUC1 均表现出丰富的多态性17-19，在 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）上可显示出由自双亲的两个共显性等位基因控制的 1 条或 2 条电泳区带。其多态性主要与分子中串联的氨基酸重复序列(20 个左右的氨基酸)的数目不同有关20。山羊乳 MUC1 在 SDS-PAGE 上表现出同奶牛乳 MUC1 相似的多态性，分子量大于奶牛乳 MUC1 分子量；兔抗山羊乳 MUC1 血清与奶牛乳MUCI 有交叉反应，而与人、豚、鼠乳 MUC1 无交叉反应。反映出不同物种MUC1 分子串联重复序列及其抗原决定簇结构存在差异19。由于乳 MUC1 分析对研究物种进化和亲缘关系及疾病防治等具有理论和实际意义，MUC1 的研究近年来引起研究人员的广泛关注，目前已对 MUC1 的分子组成和结构，如MUC1 蛋白的结构、功能及应用9；基因结构，如粘蛋白核芯肽的基因结构及其在肿瘤生物治疗中的意义21；基因表达的调控，如粘蛋白 MUC1 在膀胱瘤与膀胱良性病变中的表达及其意义22等诸多方面进行了不同程度的研究9。国内有关乳 MUC1 多态性的研究报道已见天祝白牦牛5、大熊猫23等。在山羊方面还很少。为此，我们对乐至黑山羊乳 MUC1 多态性进行了分析，以丰富该领域的研究资料。1 材料与方法材料与方法1.1 试验山羊试验山羊在四川省乐至县选择健康的泌乳乐至黑羊 35 只，手工挤取晨乳，冰冻带回实验室。同时采集这些山羊的血液，肝素抗凝。所有样品-20保存备用。1.2 主要仪器主要仪器PowerPac3000 电泳仪、MP3 垂直电泳槽、Doc1000 凝胶成像系统、TS-1型脱色摇床、Eppendorf Speed1000 离心机、HFSafe 760s 超净工作台、Eppendorf AG 22331 Hamburg PCR 仪。1.3 主要试剂主要试剂 三羟甲基氨基甲烷（Tris）购自 NOVON 公司，Universal Genomic DNA 5Extraction Kit Ver.3.0 试剂盒，2GE buffer，dNTP，LA Taq 酶，均购自宝生物工程（大连）有限公司，其他试剂均为国产分析纯。1.4 乳蛋白乳蛋白 MUC1 多态性的分析多态性的分析采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）的方法，方法如下：1.4.1 制胶：制胶：（1）将玻璃板、样品梳、胶垫用洗涤剂洗净，用 ddH2O 冲洗数次，晾干；（2）将两块洗净的玻璃板下面放置胶垫，装好玻璃板；（3）按表 1 配制 6分离胶 4ml，混匀；（4）向玻璃板间灌制分离胶，约 3.75ml，立即覆一层蒸馏水，大约 2030min后分离胶即可聚合；（5）按表 1 配制 3浓缩胶，混匀；（6）将上层蒸馏水倾去，滤纸吸干，灌制浓缩胶，插入样品梳；（7）浓缩胶凝固后将样品梳取下，配好的胶，湿润封口，4冰箱中过夜。表 1 6分离胶和 3浓缩胶成分试剂6分离胶3浓缩胶30Acr-Bis4ml0.4ml1.5mol/L Tris-HCl (pH=8.8)5ml0.5mol/L Tris-HCl (pH=6.8)1ml超纯水10.8ml2.56ml10SDS0.2ml40l抽真空后加入以下试剂10APS140l30lTEMED16l10l1.4.2 上样上样（1）制备工作液。量取 3.55ml 超纯水、0.5mol/L Tris-HCl (pH6.8)、2.5ml 甘油、2ml 的 10SDS、以及 0.2ml 的 0.5溴酚蓝后混匀后待用；（2）制备上样缓冲液。量取 50l 的 -硫基乙醇与制备好的工作液混匀后待用；（3）上样。量取样品蛋白 1l及上样缓冲液 2l于 EP 管中，95左右沸水浴45min 后快速离心，电泳槽加入电极缓冲液（0.025mol/L 的 Tris、0.192mol/L甘氨酸、0.1SDS 用超纯水定容到 1000ml）后上样，上样量为 2.5l。1.4.3 电泳电泳（1）电泳时浓缩胶电压设置为 6080V，时间设置为 1520min；分离胶电压6设置为 120150V，时间设置为 7090min，电泳时要将电泳槽至于冰水中以维持凝胶板低温，待指示剂跑出分离胶时，停止电泳。（2）卸下胶板，进行染色。1.4.4 染色染色（1）在 50甲醇10冰醋酸中震荡 30min 后，弃去废液；（2）在 5甲醇7冰醋酸中震荡 30min