鸡胚成纤维细胞的制备,鸡胚成纤维细胞的制备和培养,学习和掌握鸡胚成纤维细胞的制备和培养方法； 了解原代细胞培养的原理和方法。,实 验 目 的,CEF的培养是在一定条件下，在体外模拟体内生理环境，使从体内取出的成纤维组织细胞生存、生长和传代，并维持原有组织细胞的结构和功能特性。,鸡胚成纤维细胞元代培养,病毒能在易感的组织或单层细胞内增殖，并可产生细胞病变，因此，细胞培养是病毒学研究的重要手段，是进行病毒性疫苗生产和病毒性疾病诊断必不可少的工具。原代细胞培养是体外制备细胞培养物的必经过程，从供体体内取出组织分散成单个细胞接种于培养液中为初次培养，从初次培养到第一次传代培养为原代培养。本实验以鸡胚成纤维细胞作为原代细胞，通过细胞培养实践操作，认识和体会原代细胞的制备方法和影响细胞培养的主要因素，并掌握原代细胞培养的方法。,实 验 原 理,超净工作台，检卵灯，灭菌的细胞培养瓶、眼科剪、眼科镊、平皿、吸管、离心管等；9-11日龄鸡胚；PBS，0.25%胰酶消化液，DMEM营养液，75%酒精棉。,实验所需器材、试剂,（一）操作前的准备 1、预热培养液：把已经配制好的生长液、Hanks 液和胰蛋白酶液放入37水浴锅内预热； 2、用75%酒精棉擦拭双手和紫外线照射过的超净工作台； 3、正确摆放要使用的器械：保证足够的操作空 间，不仅便于操作而且可减少污染； 4、点燃酒精灯. 5、准备好将要使用的消毒后的培养瓶。 6、取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。,实 验 步 骤,（二）鸡胚成纤维细胞的制备 1、鸡胚的处理 （1）蛋壳消毒取9-11日龄的鸡胚，用检卵灯选取血管清楚、活动正常的鸡胚，置蛋架上，令气室端向上，用碘酒棉消毒蛋壳气室部位。 （2）胚体采集以镊子击破卵壳气室部位，并除去该部位卵壳。用无菌的眼科镊子撕开蛋壳气室膜并小心拨开绒毛尿囊膜和羊膜，用弯镊子夹住鸡胚颈部，移入灭菌的平皿内。用剪刀剪去胚头、四肢及内脏，用PBS洗去体表血液，移入灭菌小烧杯中。,实 验 步 骤,（3）胚体匀浆用灭菌剪将胚体剪碎至1mm3小碎块。加入PBS（淹住组织碎块即可），轻摇，静置1-2min，待组织块下沉，吸去上层悬液。重复2-3次（以除去其中的红细胞），至上悬液不混浊为止，移入灭菌的锥形瓶中，吸去PBS。,实 验 步 骤,2、分散细胞 （1）胰酶消化将剪碎的组织块放入锥形瓶中，加入适量的胰酶。包紧瓶口，37水域消化30min，每隔5min轻轻摇动1次。当组织块变得蓬松透明时，吸弃消化液，用PBS洗两遍，中止消化。如再继续消化，可破坏细胞膜而不易贴壁生长，如果消化不够，则细胞不易分散。,实 验 步 骤,（2）分散细胞将消化好的细胞悬液从水浴锅中取出，弃去上层液体，加5mL含血清的DMEM生长液（DMEM营养液+5%犊牛血清+100IU/ml青链霉素，用7.5%NaHCO3溶液调pH7.2），以吸管反复吹吸数次，使细胞分散，此时可见生长液混浊，即为细胞悬液。静置1min后，使未冲散的组织块下沉。 （3）过滤用4层脱脂纱布将吹打后的细胞过滤到平皿中，收集滤液。,实 验 步 骤,（三）分装与培养 1、细胞计数用细胞计数器计数，根据计数结果，加入DMEM生长液，调整细胞浓度至50万-60万个/ml。,实 验 步 骤,2、分装与培养在培养瓶中加入2mLDMEM生长液(如果是50mL的培养瓶，加4mL生长液)，小心吸出过滤后的细胞悬液0.25mL至培养瓶中（如果是50mL的培养瓶，加0.5mL的细胞悬液)，吹打均匀盖好瓶塞。在瓶上注明组别、日期，置37温箱中培养(4h后细胞即可贴壁，24-36h生长成单层细胞，此时可更换培养液，并接种病毒)。分装后2-4h不可大幅度移动培养瓶，以免影响细胞的贴壁和生长。,实 验 步 骤,（四）细胞形态观察检查时注意培养液的颜色变化，变黄但不混浊表示有细胞生长，变红表示细胞未生长或生长不佳。37培养24-48h后，于倒置显微镜下观察，细胞可以长成单层，细胞透亮，呈纤维状，细胞膜清晰。,实 验 步 骤,五、注意事项 1、整个过程严格无菌操作 2、培养液不要太多，应有足够的空间保证细胞对氧的需要 3、放入CO2培养箱培养时，将CO2浓度控制在5%。 4、吸除消化液，向瓶内注入PBS数毫升，轻轻转动培养瓶，把残余消化液冲掉。注意冲洗细胞时，动作要轻，以免把已松动的细胞冲掉流失，如用胰蛋白酶液单独消化，吸除胰酶液后，可不用PBS冲洗，直接加入培养液。 5、细胞培养对玻璃器皿洗涤要求严格，彻底洗涤后用蒸馏水冲洗，再用双蒸水冲洗，干燥 灭菌后备用。所有的溶液都要用双蒸水配制，所用药品试剂用分析纯。,实 验 步 骤,your name,