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资源描述
欢迎参加岛津液相维修培训班,采用 “HPLC” 级溶剂 避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂 对试样有适宜的溶解度 溶剂粘度要小 与检测器相匹配,流动相的选择,其他问题,其他问题,水的等级 纯化水 蒸馏水 去离子水,波长 (nm),纯化水,去离子水,因为不纯物的存在,去离子的吸光率较高,纯化水中去除了无机和有机的污染物,吸光率,其他问题,水 / MeOH梯度ODS 柱,鬼峰,Gradient Curve,1 ml/min, 0-100% MeOH over 10 mins and hold for 15 mins.,鬼峰的出现,其他问题,溶剂的等级 HPLC级 优级纯 分析纯,都经过蒸馏和0.45u的过滤(除纤维毛,未溶解的机械颗粒,优级纯的纯度比分析纯大,但里面含有防腐剂和抗氧化剂,HPLC级经过0.2u的过滤,且除去有紫外吸收的杂质,微量分析、梯度洗脱,其他问题,甲醇 乙睛 正己烷,分析纯级和 HPLC 级溶剂的吸光度比较图,其他问题,溶剂的过滤滤膜类型:聚四氟乙烯滤膜:适用于所有溶剂,酸和盐。醋酸纤维滤膜:不适用于有机溶剂,特别适用于水基溶剂。尼龙66滤膜:适用于绝大多数有机溶剂和水溶液,可以用于强酸,不适用于二甲基甲酰胺。再生纤维素滤膜:蛋白吸收低,同样适用于水溶性样品和有机溶剂,脱气:除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡 气泡对测定的影响:1)泵中气泡使液流波动,改变保留时间和峰面积2)柱中气泡使流动相绕流,峰变形3)检测器中的气泡产生基线波动,其他问题,脱气的目的,1. 防止由气泡的产生引起的故障2. 防止由溶解(在液体中的)气体量 的变动引起的检测不稳定程度1)示差折射率检测器*使折射率变化2)UV检测器(200nm以下)*溶解氧气有吸收3)荧光检测器*溶解氧气有消光作用,其他问题,其他问题,脱气的方法,1. 超身波脱气法 2. He清除法 3. 使用氟树脂膜的减压脱气法,其他问题,He清除法,调压阀,排气阀,往送液泵,流动相,过滤器,其他问题,氟树脂膜,真空室,往送液泵,真空泵,控制器,流动相,使用氟树脂膜的减压脱气法,梯度洗脱法,梯度洗脱装置: 高压梯度:用两台高压输液泵将两种溶剂输入 低压梯度:在常压下将两种溶剂(或多元溶剂)混合,然后用高压输液泵将流动相输入到色谱柱中。 梯度洗脱:优点: 可提高分离度、缩短分离时间、降低最小检测量和提高分离精度,梯度洗脱法的注意点,溶剂的纯度要高,否则梯度洗脱的重现性差 梯度混合的溶剂互溶性要好 梯度洗脱应使用对流动相组成变化不敏感的选择性检测器(如紫外吸收检测器或荧光检测器),而不能使用对流动相组成变化敏感的通用型检测器(如示差折光检测器) 查看空白实验的数据。 遵守分析周期。(最初的分析数据不采用),样 品 处 理,1. 使用流动相溶解样品- 减少溶剂峰,尤其是组分峰靠近溶剂峰时由为重要- 保证样品在流动相中的溶解度,避免样品在系统中尤其在柱中产生沉淀,其他问题,缓冲液,选择缓冲液的步骤1 .确定最佳分离状态时的流动相pH2 .选择具有与流动相的pH相近的pKa 的缓冲液(即使浓度稀也具有较强能力的缓冲液)3 .确认检测波长下缓冲液是否有大的吸收(在波长210nm附近进行检测时,不能用醋酸和 柠檬酸的缓冲液),一些代表性弱酸的pKa,pK1 pK2 pK3醋酸 4.87柠檬酸 3.13 4.76 6.40磷酸 2.16 7.2 1 12.32,其他问题,缓冲液的使用,使用前必须过滤使用后一定要进行清洗 ,以免造成腐蚀、磨损、阻塞:用纯水冲洗30-60min(1ml/min),再用甲醇冲洗30min 易受到细菌和霉菌的影响,不能直接用有机溶剂冲洗,液相色谱容易出问题的部件,维护流程图,吸滤头,单向阀,柱塞密封圈,线路过滤器,手动进样器,检测器,管线选择,材料不锈钢TeflonPEEK (聚醚酮) 尺寸0.1 mmI.D. x 1.6 mmO.D. 0.3 mmI.D. x 1.6 mmO.D.0.5 mmI.D. x 1.6 mmO.D.0.8 mmI.D. x 1.6 mmO.D.,管线材料,不锈钢 (可用于所有连接) 能承受几千 kg/cm2 压力 酸性或高浓度盐环境中易腐蚀 (尤其在pH小于2时) PEEK (可用于所有连接) 能承受高达 250 kg/cm2压力 可在整个PH范围(pH 1-14)内使用 不适用于高溶解性溶剂如氯仿等 Teflon (用于柱后阻尼管、反应管和排液管) 化学惰性大 能承受 5 kgf/cm2 压力,材料:不锈钢烧结,孔径10um 故障:堵塞 表现:管路中不断有气泡生成 措施:用520的稀硝酸,超声波清洗,再用蒸馏水清洗 注意点:吸滤头拆下时不必将塑料管剪断,吸滤头,液相色谱容易出问题的部件,LC-10ATvp泵:串联 式往复泵,LC-10ADvp泵:并联式 往复泵,液相色谱容易出问题的部件,液相色谱容易出问题的部件,单向阀结构,流动相,单向阀原理,液相色谱容易出问题的部件,故障1:宝石球粘附于垫片 表现:泵无法吸液或排液,流路不通 措施:1)用针筒抽出口单向阀以产生负压,使宝石球与垫片分开2)拆下单向阀,放入异丙醇或水中,用超声波清洗,单向阀,液相色谱容易出问题的部件,故障2:宝石球或塑料垫片受污导致密封不好 表现:系统压力波动大 措施:拆下单向阀,放入异丙醇或水中,用超声波清洗,单向阀,故障:密封圈磨损而导致密封不良 现象:系统压力波动大或漏夜措施:更换密封圈 注意点:更换密封圈拆卸泵头前,柱塞杆复位 (PSET),柱塞密封圈,液相色谱容易出问题的部件,故障:堵塞 现象:系统压力波动大或压力偏高 措施:5稀硝酸,超声波清 洗 判断依据:关闭排液阀,断开出口管路,设定流速1mL/min,如压力3kgf/cm2,则可能堵塞。,线路过滤器,排液阀,压力传感器,线路过滤器,流动相,液相色谱容易出问题的部件,液相色谱容易出问题的部件,进样器,自动进样器 手动进样器原理:(六通阀)注入方式:1)全量注入2)部分注入,液相色谱容易出问题的部件,进样量和检测器响应的关系示意图,进样体积,检测器响应值,定量环体积的一半,3倍定量环体积,全量注入,部分注入,手动进样器的原理图,装填状态,进样状态,交叉污染的原因,便捷的方法(不需清洗)1.进样状态下插入微量注射器2.切到装填状态3.注入样品4.切回到进样状态,手动进样法,操作注意点: 1)插针应插到底 2)进样应使用液相色谱专用平头进样针 3)清洗应使用专用针口清洗器,手动进样器,定子,转子,塑料箍,弹簧,不锈钢套,液相色谱容易出问题的部件,手动进样阀故障:转子密封损坏现象:漏液原因:a 拧的太紧b 样品太脏c 针头损坏或不使用液相专用针解决措施:更换转子密封,并在使用,液相色谱容易出问题的部件,液相色谱容易出问题的部件,手动进样阀故障:载样困难原因:a 定量环堵塞b 进样器污染解决措施:清洗或更换定量环、进样器,液相色谱容易出问题的部件,分析结果重现性好 提高柱效 降低柱压 保证检测稳定性,柱子故障:系统高压、峰型变差(拖尾峰、前沿峰、分叉峰),保留时间的改变解决措施:清洗正相柱,正庚烷、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇反相柱,甲醇、乙腈、氯仿、异丙醇、0.05M稀硫酸,液相色谱容易出问题的部件,液相色谱容易出问题的部件,峰产生有肩或分叉的原因,1. 柱子劣化(进口处产生不均匀的空隙) 2. 样品劣化(生成氧化物、分解物等),判断标准所有的峰都产生有肩峰或分叉时则为柱子劣化,延长柱寿命方法:倒冲柱换过滤片修补柱头,液相色谱容易出问题的部件,液相色谱容易出问题的部件,柱的补修,填料的取出,液相色谱容易出问题的部件,恢复例,液相色谱容易出问题的部件,硅胶基底,聚合物基底,pH 范围,2 - 7.5,宽范围,有机溶剂,所有,有限制,压力, 250 kgf/cm2,低压,温度,宽范围,60C,色谱柱的类型及适用范围,液相色谱容易出问题的部件,分 析 柱 的 维 护,在使用新柱之前,最好用强溶剂在低流量下 (0.2-0.3 ml/min)冲洗 30 mins,长时间未用的分析柱也要同样 处理 定期使用强溶剂冲洗柱子 3、使用缓冲盐时,要先用水冲洗,再用有机溶剂冲洗 4、净化样品 5、分离条件 6、不使用时,要盖上盖子,避免固定相干枯 7、使用预柱 8、避免流动相组成及极性的剧烈变化 9、避免压力脉冲的剧烈变化,液相色谱容易出问题的部件,柱压低于150kgf/cm2 柱温在40左右,最高使用温度为50 缓冲液PH使用范围为27 流动相有机溶剂比例过低, 柱效下降快,硅胶在PH为34时稳定性最好 碱浓度越低,流动相含水量越低,硅胶越稳定。,ODS柱的使用注意点:,液相色谱容易出问题的部件,紫外检测器,参比池,样品池,光线,光电倍增管,液相色谱容易出问题的部件,更换氘灯(紫外检测器),判断氘灯能量:设定220nm波长,检查参比池能量,如 能量低于800,需更换氘灯。操作注意点:不要用手直接接触氘灯表面,液相色谱容易出问题的部件,液相色谱容易出问题的部件,故障:样品池受污 表现:样品池和参比池能量相差较大 检查方法:设定250nm波长,通甲醇或水,查看SMPL EN和 REF EN,如两者相差较大,则样品池受污。 措施:用针筒注入异丙醇,清洗样品池;如污染严重, 拆开样品池,将透镜等放入异丙醇中超声波清洗。,紫外检测器,示差折光检测器,原理:连续测定流通池中溶液折射率来测定试样中各组分浓度。 优点:通用型检测器, 缺点: 1)对温度变化敏感 2)对溶剂组成变化敏感,不能用于梯度检测 3)属于中等灵敏度的检测器,液相色谱常见问题及其对策,液相色谱常见问题类型A. 压力异常(偏高、波动)B. 漏液 C. 保留时间漂移D. 基线问题(漂移、噪声) E. 峰形异常,现象:无压力,流动相不流动 可能原因1、保险丝断或电源问题2、柱塞杆折断3、泵头内有空气或流动相不足4、单向阀损坏5、漏液6、压力传感器损坏(流动相流动正常,但无压力),压力异常,现象:压力持续偏高或不断上升1、流速设定过高2、保护柱或柱子筛板堵塞3、流动相使用不当或有缓冲盐析出4、色谱柱选择不当5、进样阀损坏6、线路过滤器堵塞,压力异常,压力异常,现象:压力持续偏低1、流速设定过低2、色谱柱选择不当3、柱温过高4、系统漏液,现象:压力持续偏低1、流速设定过低2、色谱柱选择不当3、柱温过高4、系统漏液,压力异常,压力异常,现象:压力波动 可能原因1、泵头中有气泡2、单向阀损坏3、柱塞密封圈损坏4、脱气不充分5、系统漏液6、使用了梯度洗脱,漏液,接头处漏液1、接头处松动2、接头磨损3、接头被污染4、部件不匹配,漏液,泵漏液1、单向阀松动2、泵密封损坏3、放空阀损坏4、接头松动(不要拧的太紧),漏液,泵漏液1、单向阀松动2、泵密封损坏3、放空阀损坏4、接头松动(不要拧的太紧),进样阀漏液可能原因1、转子密封损坏2、定量环堵塞3、进样口密封松动4、进样针尺寸不合适5、废液管产生虹吸6、废液管堵塞,漏液,检测器漏液可能原因1、流通池垫片损坏2、流通池透镜破碎 3、手紧接头处漏液4、进样针尺寸不合适5、废液管堵塞6、流通池堵塞,
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