1,课程总结 和 部分技术介绍,2,第二章 分子生物学常用基本技术实验1 重组质粒实验2 质粒转化大肠杆菌实验3 阳性单菌落扩增与小量DNA制备实验4 酶切重组质粒，电泳分离所插入的DNA实验5 从凝胶中回收DNA,3,实验6 大量质粒DNA制备,4,实验7 哺乳类动物细胞的培养实验8 植物细胞悬浮培养技术,5,第三章 DNA的研究方法目的：（1）获得目的DNA（人、动物、植物；组织、细胞），开展基因组的研究。（2）扩增目的DNA的量。（3）了解DNA大体结构（亲子鉴定/破案）。（4）了解DNA缺失、突变、保护、修复。（5）了解DNA功能和功能域确定。（6）启动子研究：启动子结构、增强子、甲基化。,6,实验9 哺乳类动物基因组DNA的提取（类似于RNA的提取）实验10 植物基因组DNA的提取（采用抗氧化剂或强还原剂以降低植物细胞中氧化酶类的活性）实验11 基因组文库的建立与筛选（类似于cDNA文库的建立与筛选）实验12 Southern blot （类似于Northern blot ）,7,实验13 PCRPCR是Polymerase chain reaction的缩写，中文译作聚合酶链式反应。其特点是可以在几小时内方便、快捷地将微量DNA（含由微量RNA反转录成的cDNA）扩增达106倍，得到ug级的DNA！该技术发明于八十年代中期，到了八十年代末，由于引用了耐热DNA聚合酶，使这一技术得以蓬勃发展，成为分子生物学中应用最为广泛的技术。该技术在中医药实验研究和临床检测中应用十分广泛。例如观察慢性炎症的活检组织中一些与肿瘤发生的基因是否存在突变，中医药治疗后防突变的作用如何（如同一患者气管脱落细胞与血细胞比较）等。,8,原理：,9,注意事项PCR的常见问题主要有：1没有PCR产物。其主要可能有PCR反应的有关试剂缺乏，循环次数不够，退火温度太高，引物设计不好，模版不够，模版质量差，变性温度过高或过低，变性时间过长或过短，链延伸时间过短，Taq酶数量不够或质量不行，Mg+过低，dNTP过少，模版C/G过于丰富，等等。2PCR产物不纯，见多条条带产物。其主要可能有循环次数太多，退火温度过低，引物设计不合理，污染等。其中，引物设计不合理的可能性最大。3PCR产物前后一片，拖带。其主要可能有循环次数太多，退火温度太低，链延伸时间过长，模版质量差，模版过多，污染，Taq酶数量过多，Mg+过多，等等。,10,4关于引物（1）引物的长度。引物的长度要求不一，如模版是单一的载体和单一的插入片段，可以选用较短的插入片段两侧的载体序列作为引物，一些常用载体有现成的引物商品，可以购买。对于复杂的基因库，或反转录产物，为提高引物的特异性，建议采用较长的引物。具体可以参见RACE PCR介绍。（2）引物的CG与AT的比例。可能的话，建议1:1左右。（3）引物的计算机设计参见本书RTPCR介绍。5关于酶。一些实验反复失败，竟然会与酶的质量问题有关。因此，我们建议购买那些经常从事PCR实验的实验室所经常使用品牌及其供应商的PCR酶。,11,6退火温度。通常按照检索到的文献或试剂盒提供的方法，可以确定退火温度。但是，时常会碰到两条引物的Tm值不一致，或PCR反复调整仍不见改善，此时可以考虑Touch-Down-PCR的方法，具体参见本书RACE-PCR介绍。7CG丰富的DNA模版往往不容易扩增。对此，可以采用DMSO（DIMETHYL SULFOXIDE），用量为PCR反应总容积的1/10。比如将4ul的DMSO加入36ul的PCR反应液，使总容积达40ul。8MgCl2。通常PCR buffer中含有MgCl2，但是由于一些不清楚的原因，有时仍嫌不足，此时可以适当增加MgCl2的浓度。,12,9PCR是一种十分灵敏的实验，对操作技巧要求高，为防止加样误差，建议做复管。同时，同时进行多个反应时，相同的试剂建议先一道配制，并留有余量，比如Taq酶、10PCR Buffer、dNTP、消毒过的双蒸水等，混匀，这样可以很大程度上避免上样误差。10关于电泳参见本书有关章节。11关于试管。为提高PCR的质量，以及大批量PCR反应的操作，目前业已开发出不同的PCR试管。比如为减少管壁导热的延滞，发展出超薄壁的PCR试管；为满足批量实验，发展出排状PCR试管，等等。我们在实验中先后使用过一些不同的试管，从操作方便和安全上看仍喜欢采用0.5ml的试管。这样的试管比较结实，不宜引起试管的破裂和同位素的泄漏，且手持起来方便。,13,实验14 DNA双脱氧链终止法测序目的：1了解目的DNA序列，如获得的DD-PCR片段。2了解目的基因是否发生了突变、缺失。例如经中医药治疗或处理后是否可以阻止或纠正病变组织基因组的突变。3一些实验如Footprint要求在足迹电泳的一侧有DNA的序列，以明确核蛋白所结合启动子的区域。 鉴定某一基因是否为目的基因。测序有一些不同的方法及其改良法，比如化学降解测序法，九十年代还发展起来多种自动测序仪，并不断升级换代，给大量的测序工作提供了快捷、便利的条件。若测序工作量不大，或没有自动测序仪，可以采用本实验介绍的方法。,14,原理：,15,实验结果：,16,实验15 动、植物药材的ISSR指纹图谱技术（单一引物对目标组织微卫星序列PCR扩增） 实验16 中药RAPD指纹图谱技术（随机多态核苷酸引物对目标组织基因组DNA的PCR 扩增）,17,第四章 RNA的研究方法（1）获得RNA（人、动物、植物；组织、细胞），开展转录组学研究。（2）了解RNA的质量和特征。（3）获得mRNA。（4）扩增目的RNA。（5）了解目的RNA的表达量RT-PCR和Northern blot。（6）了解目的RNA的表达的位置和表达量原位杂交。（7）了解目的RNA序列。,18,正常小鼠垂体RNA图谱 邪毒壅盛小鼠垂体RNA图谱 气虚小鼠垂体RNA图谱,阳气虚小鼠垂体RNA图谱 气阴阳虚小鼠垂体RNA图谱 RNA降解,实验17 组织总RNA提取,19,实验18 mRNA的分离实验19 Northern blot,20,实验20 RT-PCR实验21 ABI荧光实时定量PCR,21,实验22 原位杂交实验23 基因芯片MicroArray的工作原理是将欲研究细胞组织的RNA通过不同的方式转录成cDNA，转录过程中或之后给予荧光等标记，制成探针，然后在严格的条件下使该探针与微矩阵上的基因杂交，杂交后，把未杂交的基因洗脱，在一定的条件下，观察杂交结果，以了解某特定组织中基因转录的多寡和特征。如果两个组织的RNA用不同发光色彩的荧光标记，同时进行杂交，由于两个组织杂交后所激发的荧光色彩不同，微矩阵上与甲组织特有探针结合则产生甲探针的光色，与乙组织特有探针结合则产生乙探针的光色，两种探针同时结合则产生相兼色。这样在一块基因芯片上就可以方便、迅速、大规模地观察两个不同组织基因转录的异同。,22,23,在基因芯片问世的短短几年来，一些改进型的基因芯片技术陆续问世，并迅速形成产品。比如GeneChip。其特点为：（1）容量大，每个芯片上可以达39000个基因/百万个探针，因此，单位时间内识别的基因多且快；,24,（2）在基因矩阵上每个点由上下两排更小的矩阵组成，每排由1620个与某一mRNA不同区域对应的25个寡核苷酸组成。上下两行中，上行为正常基因序列，下行为中间有点突变的序列。这样在相同严格的杂交和洗脱条件下，上行基因1620个点应该全部阳性反应，而下行基因因含有点突变，退火结合后不够稳定，会被洗脱。因而这样仅上行呈阳性的杂交才算有效。所以在避免假阳性方面具有别的芯片所无法比拟的优势。,25,使用基因芯片技术还有以下一些问题：1要求专门设备，国内尚未普及。2研究成本高。3不是所有常用生物均有全RNA组芯片。4实验数据庞大。5大量的基因功能还不明朗。,26,虽然如此，基因芯片技术已展现出绚丽的前景：1已经出品了人类全套基因组芯片，使基因芯片完全实用。2当基因芯片生产技术趋于成熟，开始批量化、规模化生产，降低售价，便于普及。3生物计算技术的发展，芯片结果自动化分析程度增加，将使人类更好、更快地驾驭基因芯片的海量信息。4不同基因功能研究的积累，以及基因功能研究技术的发展与普及，使基因芯片研究的后续工作得以有效的开展，基因芯片的学术价值将得到革命性的发展。5互联网海量生物信息开放和不断丰富，以及有关计算机辅助系统的发展与升级，使芯片结果的分析与深入研究空前的便利。,27,Affymetrix Rat 230A GeneChip,28,Affymetrix GeneChip mouse Exon 1.0 ST Array,外显子芯片 基因的剪接差异 产物的多样化,29,POMC的表达产物可以是-内啡肽或ACTH,小鼠POMC基因全长5.668 kb，位于染色体12的3954967（或3954951）到 3960634（或3960618）。该基因有3个外显子，其起始位置大体为：39549673955070（103bp），39581003958280（180bp），39599003960634（734bp）。后两个外显子存在编码区。合计1017bp左右。,30,translation=“MPRFCYSRSGALLLALLLQTSIDVWSWCLESSQCQDLTTESNLLACIRACKLDLSLETPVFPGNGDEQPLTENPRKYVMGHFRWDRFGPRNSSSAGSAAQRRAEEEAVWGDGSPEPSPREGKRSYSMEHFRWGKPVGKKRRPVKVYPNVAENESAEAFPLEFKRELEGERPLGLEQVLESDAEKDDGPYRVEHFRWSNPPKDKRYGGFMTSEKSQTPLVTLFKNAIIKNAHKKGQ“（1）1-MSH（1促黑素细胞激素，YVMGHFRWDRF）。 （2） 2-MSH（2促黑素细胞激素，YVMGHFRWDRFG）。 （3） 3-MSH（3促黑素细胞激素，YVMGHFRWDRFGPRNSSSAGSAAQ）。（4） ACTH（SYSMEHFRWGKPVGKKRRPVKVYPNVAENESAEAFPLEF）。 （5） -MSH（促黑素细胞激素，SYSMEHFRWGKPV）。 （6） CLIP（corticotropin-like intermediate lobe peptide，中间叶促皮质样肽）。（7） -LPH（lipotropin，促脂解素）。 （8） -LPH（lipotropin，促脂解素）。 （9） -END（-内啡肽，YGGFMTSEKSQTPLVTLFKNAIIKNAHKKGQ）。 （10） -END（-内啡肽，YGGFMTSEKSQTPLVT） （11） -END（-内啡肽，YGGFMTSEKSQTPLVTL） （12） -END（-内啡肽，YGGFMTSEKSQTPLVTLFKNAIIKNAH） （13） - MSH（促黑素细胞激素）。,31,小鼠外显子芯片，有关POMC基因，有4组探针，第4组基本不表达（作图取前3组探针）。其中，探针2落在ACTH内。4组探针杂交结果如下： AAACGGGAGGCGACGGAAGAGAAAAGAGGTTAAGAGCAGTGACTAAGAGAGGCCACTGAACATCTTTGTCCCCAGAGAGCTGCCTTTCCGCGACAGGGGTCCCTCCAATCTTGTTTGCCTCTGCAGAGACTAGGCCTGACACGTGGAAGATGCCGAGATTCTGCTACAGTCGCTCAGGGGCCCTGTTGCTGGCCCTCCTGCTTCAGACCTCCATAGATGTGTGGAGCTGGTGCCTGGAGAGCAGCCAGTGCCAGGACCTCACCACGGAGAGCAACCTGCTGGCTTGCATCCGGGCTTGCAAACTCGACCTCTCGCTGGAGACGCCCGTGTTTCCTGGCAACGGAGATGAACAGCCCCTGACTGAAAACCCCCGGAAGTACGTCATGGGTCACTTCCGCTGGGACCGCTTCGGCCCCAGGAACAGCAGCAGTGCTGGCAGCGCGGCGCAGAGGCGTGCGGAGGAAGAGGCGGTGTGGGGAGATGGCAGTCCAGAGCCGAGTCCACGCGAGGGCAAGCGCTCCTACTCCATGGAGCACTTCCGCTGGGGCAAGCCGGTGGGCAAGAAACGGCGCCCGGTGAAGGTGTACCCCAACGTTGCTGAGAACGAGTCGGCGGAGGCCTTTCCCCTAGAGTTCAAGAGGGAGCTGGAAGGCGAGCGGCCATTAGGCTTGGAGCAGGTCCTGGAGTCCGACGCGGAGAAGGACGACGGGCCCTACCGGGTGGAGCACTTCCGCTGGAGCAACCCGCCCAAGGACAAGCGTTACGGTGGCTTCATGACCTCCGAGAAGAGCCAGACGCCCCTGGTGACGCTCTTCAAGAACGCCATCATCAAGAACGCGCACAAGAAGGGCCAGTGAGGGTGCAGGGGTCTTCTCATTCCAAGGCCCCCTCCCTGCATGGGCGAGCTGATGACCTCTAGCCTCTTAGAGTTACCTGTGTTAGGAAATAAAACCTTTCAGATTTCACAGTCGGCTCTGATCTTCAATAAAAACTGCGTAAATAAAGTC * Affy的3组探针（每组4个探针）：探针组1、探针组2、探针组3、探针组4，ACTH 编码区、内啡肽 编码区。第2外显子。,