Q&A,关于PCR结果分析 关于产物回收 漂洗作用：换缓冲液，除杂 乙醇：保存目的产物 离心：去乙醇，除液体，保证后续工作补救：勿轻易弃置； 高盐结合，重复漂洗。 关于,1 2 3 4 5 6 M 7 8 9 10 11 12,Fig. 1 Agarose Electrophoresis analysis of the PCR products. Lane 1Lane 12：products of PCR M：DNA marker （from top to bottom：2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp）,相邻泳道溢出污染,非特异性！,！PCR仪中的 位置,边缘效应？,！,胶融！外溢,胶融！,质粒DNA的提取 及其定性定量分析,基因的克隆与表达专题之二,主要内容,一、质粒DNA提取 二、琼脂糖电泳鉴定及半定量 三、紫外吸收定量及纯度检测,基本原理,结构差别 分子量差别 变性复性,SDS碱裂解,碱裂解 碱变性,一、质粒DNA的提取流 程,接含pETBlue-2(质粒的单菌落于4mL LB 羧苄（50ug/mL ）和四环素（12.5ug/mL）液体培养基中 370C，190rpm振荡培养过夜 4000rpm、离心1min，收集所有菌体 150uL溶液I悬浮菌体（旋涡混匀），室温10min 加入200uL溶液II（轻轻混匀!），室温静置菌液裂解变清,接菌,培养,收菌,碱裂解, 加入200uL溶液III（轻轻混匀!），冰上静置15min质粒DNA复性 12000rpm，离心10min 上清加等体积的酚：氯仿：异戊醇（旋涡混匀） 12000rpm，离心5min 上清加等体积的氯仿：异戊醇（旋涡混匀） 12000rpm，离心5min ,复性回收,纯化,上清加2倍体积的无水乙醇（旋涡混匀），室温 30min 12000rpm，离心10min 沉淀用75%乙醇1mL洗涤两次（振荡混匀、离心） 12000rpm，离心5min 沉淀于超净台中风干（5min20min） 沉淀加入20uL RTE，600C水浴30分钟溶解 -200C保存,醇沉回收,溶解,保存,离心标识,碱裂解,溶液冰浴 pH 8.0 剧烈振荡 10 min 溶液粘稠混浊,碱裂解,溶液现用现配 切勿振荡！颠倒混匀 T 5min SDS包被,！,复性回收,溶液冰上预冷 切勿振荡！颠倒混匀 15min 仅质粒复性？在哪相？,！,制 胶：1%琼脂糖（20 mL，1xTAE) 缓冲液：1xTAE，130 mL 制 样：质粒DNA 2L 10xloading 0.5L Marker：5L 电 泳：80伏恒压 结果分析：鉴定（定性，纯度）；半定量,二、质粒DNA的电泳,测定流程：质粒DNA稀释100倍（用TE缓冲液稀释），总体积300 L 检测波长： 定量：C=OD260*50*稀释倍数（ g/mL ） 纯度指标：,三、质粒DNA的紫外吸收检测,260nm核酸 280nm蛋白,下次实验的简介与准备,DNA 重 组酶切和连接,基因的克隆与表达专题之三,预实验中如何进行对照？ 思考：工程菌的常用种类及用途？ 质粒的种类及特性？ 分子生物学中常用的内切酶？连接酶？ 抗生素种类？为什么应用抗生素？ 灭菌：1mL、200L、 10L枪头各一盒 1.5mL小指管 40个,加油啊！,关于PCR退火条件摸索,