游离a氨基酸含量的测定,目的与要求,实验的重点和难点,仪器和试剂,基本操作,实验原理,实验内容,数据记录和处理,注意事项,思考题,实验目的与要求,1、了解分光光度法测定游离氨基酸的原理与方法；,2、掌握分光光度计的使用。,重点和难点,分光光度计的使用与标准曲线的制作,仪器和试剂,仪 器,721型分光光度计 恒温水浴槽 漏斗25mL比色管 5mL吸量管 研钵,试剂,pH5.0的缓冲液,1水合茚三酮溶液,0.1抗坏血酸,氨基酸标准溶液,鲜蘑菇,基 本 操 作,1）吸量管的使用,2）比色管的使用,3）721分光光度计计的使用,实验原理,氨基酸在pH=5.0的溶液中与茚三酮共热时，与茚三酮作用生成蓝紫色化合物。该化合物的最大吸收波长为570nm，根据朗伯比尔定律，采用分光光度法测定其吸光度，通过标准曲线法进行定量分析，求出样品中氨基酸的浓度。,实验内容,称1.0g剪碎的新鲜蘑菇放入研钵中，加入2mL蒸馏水，研磨成匀浆，再转入7号25mL比色管，然后用6mL蒸馏水分三次洗涤研钵，分别转入7号比色管，再置于80水浴槽加热10分钟后用冷水冷却，再用蒸馏定容至25mL。摇匀后，过滤，将滤液置于8号比色管以备用。,1、样品中游离a氨基酸的提取：,在6支比色管中，按下表顺序与用量加入试剂：,摇匀后，将上述6支比色管置于80水浴槽加热15分钟后用冷水冷却，再用缓冲液定容至25mL，摇匀。,从8号比色管移取1.00mL溶液于9号25mL比色管，在分别加入3.00mL缓冲溶液、2.00mL茚三酮溶液和4滴抗坏血酸，摇匀后置于80水浴槽加热15分钟后用冷水冷却，再用缓冲液定容至25mL，摇匀。以1号比色管溶液为参比液测出样品的吸光度，从标准曲线上查到对应的氨基氮的含量，按下公式计算样品中氨基氮的含量：,3、样品含量的测定,K为查标准曲线所得氨基氮含量（ug）m为样品称取量（g）,在坐标纸上画出标准曲线，并查得样品管中的氨基氮含量K值，计算初鲜蘑菇中的氨基氮含量。,数据处理,1、显色反应应控制在85以内，否则溶液易退色；显色反应后在50分钟内应完成测量任务，否则溶液会退色。2、加抗坏血酸可减少氧气对显色影响，但用量要严格控制。3、蒸馏水最好是无氨蒸馏水。4、水合茚三酮不要溅到皮肤上。,注 意 事 项,1、简述721型分光光度计的操作步骤。2、实验过程为何使用无氨蒸馏水。,思考题,