第 2 章 DNA重组克隆的单元操作,1、DNA重组克隆所需的基本条件,2、DNA重组克隆的操作过程,3、目的基因的克隆与基因文库构建,1、DNA重组克隆所需的基本条件,C 用于基因转移的受体菌或细胞,B 用于基因克隆的载体,A 用于核酸操作的工具酶,A 用于核酸操作的工具酶,限制性核酸内切酶,DNA连接酶,DNA聚合酶,核酸酶,核酸修饰酶,限制性核酸内切酶,1. 限制性核酸内切酶的发现及其生物功能,细菌的限制与修饰现象,hsd R：编码限制性核酸内切酶,hsd M：编码限制性甲基化酶,hsd S：协助两种酶识别特定的作用位点,限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片段。,（1）限制（Restriction）,细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。,（2）修饰（Modification）,限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（4-8bp），并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。,存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵。,2. 限制性核酸内切酶的命名,属名 种名 株名,H i n d III,Haemophilus influenzae d 嗜血流感杆菌d株,同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶,3. 限制性核酸内切酶的类型,主要特性 I 型 II 型 III 型,蛋白结构,异源三聚体,同源二聚体,异源二聚体,切割位点,距识别序列1kb处,识别序列内或附近,距识别序列下游,随机性切割,特异性切割,24-26bp处,4. II 型限制性核酸内切酶的基本特性,识别双链DNA分子中4 - 8对碱基的特定序列,大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧,识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构,5 G C T G A A T T C G A G 3,3 C G A C T T A A G C T C 5,EcoR I的识别序列,EcoR I的切割位点,EcoRI等产生的5粘性末端,EcoRI 37 ,退火 4-7 ,5 G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G 3,3 C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C 5,OH,P,OH,P,PstI等产生的3粘性末端,5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5,PstI 37 ,5 G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C 5,退火 4-7 ,5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 3,3 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5,OH,P,OH,P,EcoRV等产生的平头末端,5 G-C-T-G-A-T-A-T-C-G-A-G 3,3 C-G-A-C-T-A-T-A-G-C-T-C 5,EcoRV 37 ,同裂酶：识别位点与切割位点均相同的不同来源的II型酶。,同尾酶：识别位点不同，但能切出相同粘性末端的II型酶。,5. II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作,大部分II 型核酸内切酶需要相似的反应条件：,Tris-HCl,50 mM pH 7.5,MgCl2,10 mM,NaCl,50 - 150 mM,DTT,1 mM,50 mM 低盐酶,100 mM 中盐酶,150 mM 高盐酶,Volume,20 - 100 ml,T T,37 1 - 1.5 hr,1 U 核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应 1 小时，完全,水解 1 mg pBR322 DNA所需的酶量。,II 型核酸内切酶的多酶联合酶解：,对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意：,5 GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT3,3 CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA5,BamHI SmaI,5 GCTACATG GATCCCGGGTTCGCAT3,3 CGATGTACCTAG GGCCCAAGCGTA5,5 GCTACATGGATCCC GGGTTCGCAT3,3 CGATGTACCTAGGG CCCAAGCGTA5,对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：, 使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解。, 低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切；, 一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切,i. 0.1倍体积的 5 M NaAc pH 5.4,ii. 2倍体积的冰冷乙醇,iii. 冰浴 15 分钟、高速冷冻离心10分钟、干燥,6. 影响限制性核酸内切酶活性的因素,DNA样品的纯度：,蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等,DNA样品的甲基化程度：,大肠杆菌中的dam甲基化酶在5GATC3序列中的腺嘌呤,N6位上引入甲基，受其影响的酶如Bcl I、MboI等。,大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5CCAGG3或5CCTGG3序,列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶如EcoR II等。,温度：,不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37 oC，少数要求40-65 oC。,核酸内切酶的用量及缓冲液性质：,高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的Star activity现象。,DNA连接酶,1. T4-DNA连接酶的基本性质,修复双链DNA上缺刻处的磷酸二酯键,T4-DNA连接酶,5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 3,3 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5,OH,P,OH,P,5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5,nick,nick,修复与RNA链结合的DNA链上缺刻处的磷酸二酯键,连接多个平头双链DNA分子,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5,T4-DNA连接酶,2. DNA连接酶的反应条件,Tris-HCl,50 - 100 mM pH 7.5,MgCl2,10 mM,ATP,0.5 - 1 mM,DTT,5 mM,Volume,10 - 20 ml,T T,4 - 15 4 - 16 hr,1 U DNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15 反应 1 小时，,完全连接 1 mg l-DNA（Hind III片段）所需的酶量。,3. 平头双链DNA片段的连接操作, 加大连接酶用量, 加大平头末端底物的浓度, 加入10% PEG8000, 加入单价阳离子（NaCl）,提高平头末端连接效率的方法包括：,DNA聚合酶,1. 大肠杆菌DNA聚合酶 I（ DNA pol I ）, 53的DNA聚合酶活性,大肠杆菌DNA聚合酶 I的基本性质：,3 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A 5,5 C-G-A-G-T-OH,5 ppp dN Mg2+,3 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A 5,5 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OH,DNA pol I,5 A G C T T C A G G A T A 3| | | | | | | | | | |,3 T C G A A G T C C T A G 5, 53的核酸外切酶活性, 35的核酸外切酶活性,C,切口平移法(nick translation ),大肠杆菌DNA聚合酶 I 的基本用途：,2. 大肠杆菌DNA聚合酶 I 大片段（ Klenow ）,Klenow酶的基本性质：,53的DNA聚合酶活性 35的核酸外切酶活性,无53的核酸外切酶活性,DNA Pol I Klenow fragment (76KD）,枯草杆菌蛋白酶, 补平由核酸内切酶产生的5粘性末端,5 G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 3,3 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C 5,Klenow,dATP dTTP,5 G-C-T-G-A-A-T-T-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 3,3 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-T-T-A-A-G-C-T-C 5,Klenow酶的基本用途：, DNA片段3末端的同位素标记,5 G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 3,3 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C 5,Klenow,a-32P-pppdA dTTP,5 G-C-T-G-A-A-T-T-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 3,3 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-T-T-A-A-G-C-T-C 5, cDNA第二链的合成, 双脱氧末端终止法测定DNA序列,3. T4-DNA聚合酶,T4-DNA酶的基本特性：,在无dNTP时，可以从任何3-OH端外切,在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位,53的DNA聚合酶活性和35的核酸外切酶活性,5,3,3,5,T4-DNA聚合酶的基本用途：,5 G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-P HO-A-C-G-T-C-C-T-C 5,T4-DNA聚合酶,5 G-C-T-C- OH P-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-P HO -C-C-T-C 5, 切平由核酸内切酶产生的3粘性末端, DNA片段3末端的同位素标记,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5,Mg2+ 5 ppp dN 5 ppp dA（a-32P-dATP）,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-OH,