11 DNA重组技术的基本工具 12 基因工程的基本操作程序,高频考点突破,11 DNA重组技术的基本工具,基础自主梳理,命题视角剖析,即时达标训练,12 基因工程的基本操作程序,基础自主梳理,一、DNA重组技术的基本工具 1限制性核酸内切酶“分子手术刀” (1)主要来源：原核生物。 (2)特点：能够识别DNA特定的_，切开两个核苷酸之间的_。 (3)DNA末端：限制酶切割DNA产生的DNA末端有两种形式：_和平末端。,核苷酸序列,磷酸二酯键,黏性末端,2DNA连接酶“分子缝合针” (1)作用：将双链_ “缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_。 (2)种类 Ecoli DNA连接酶：只能缝合DNA的黏性末端. T4DNA连接酶：既可缝合DNA的黏性末端，又可缝合双链DNA的_。 3基因进入受体细胞的载体“分子运输车” (1)载体的种类 质粒。 噬菌体的衍生物。 动植物病毒。,DNA片段,磷酸二酯键,平末端,(2)质粒载体的特点 能够在细胞内自我复制。 具有一个或多个_，便于供外源DNA片段插入其中。 具有特殊的遗传标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。 二、基因工程的基本操作程序 1目的基因的获取 (1)目的基因：指编码蛋白质的_。 (2)获取目的基因的方法 从基因文库中获取目的基因,限制酶切割位点,结构基因,受体菌,所有,c目的基因的获取依据： ()基因的核苷酸序列； ()基因的功能； ()基因在染色体上的位置； ()基因的转录产物mRNA； ()基因的翻译产物蛋白质。 利用PCR技术扩增目的基因 aPCR的含义：是一项在生物体外_特定DNA片段的核酸合成技术。 b条件：已知基因的核苷酸序列。c过程：目的基因受热形成单链DNA，与引物结合，在_的作用下延伸形成DNA。 d方式：指数扩增2n(n为扩增循环的次数),复制,DNA聚合酶,人工合成法：若基因较小、核苷酸序列已知，可以人工合成。 2基因表达载体的构建 (1)表达载体的组成：目的基因_终止子标记基因。 (2)表达载体的功能 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代。 使目的基因_和发挥作用。 (3)启动子：位于基因的_，它是_识别和结合的部位，驱动基因转录产生mRNA。 (4)终止子：位于基因的尾端，终止mRNA的转录。 (5)标记基因：鉴别受体细胞是否含有目的基因。,启动子,表达,首端,RNA聚合酶,3将目的基因导入受体细胞 转化的含义：目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内维持_的过程。 (1)将目的基因导入植物细胞 方法：农杆菌转化法；_枪法；花粉管通道法。 (2)将目的基因导入动物细胞 方法：_注射技术。 操作程序：目的基因表达载体_取卵(受精卵)显微注射移植到雌性动物体内新性状的动物。,稳定和表达,基因,显微,提纯,(3)将目的基因导入微生物细胞 原核生物特点：繁殖快、多为_、遗传物质少。 转化：用Ca2处理细胞感受态细胞表达载体与感受态细胞混合促感受态细胞吸收DNA分子。,单细胞,4目的基因的检测与鉴定 (1)检测 方法：采用_技术，抗原抗体杂交技术。 内容： a检测转基因生物的染色体DNA上的目的基因。 b检测目的基因是否转录出了_。 c检测目的基因是否翻译成_。 (2)鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定等。,DNA分子杂交,mRNA,蛋白质,高频考点突破,【易误警示】 限制酶与DNA连接酶的关系 限制酶不切割自身DNA的原因是：原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。 DNA连接酶起作用时不需要模板。,即时应用(随学随练，轻松夺冠) 1(2009年高考浙江卷)下列关于基因工程的叙述，错误的是( ) A目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物 B限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两类常用的工具酶 C人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性 D载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基因的表达,解析：选D。基因工程中目的基因来源于自然界中的含有目的性状的一切生物，可以是动物、植物，也可以是真菌、细菌，还可以是人等；在基因工程中获取目的基因以及将目的基因和载体结合构成基因表达载体必须使用同一种限制酶进行切割，已获得相同的黏性末端，再在DNA连接酶的作用下，将目的基因和载体连接，构成基因表达载体；人的胰岛素原基因可以在大肠杆菌体内得以表达，但是由于大肠杆菌是原核生物，没有内质网、高尔基体等细胞器的加工，合成的胰岛素原不具有胰岛素的功能，即没有生物活性；作为标记基因，有利于重组基因在细胞内表达的鉴定筛选，但对于目的基因的表达没有促进等调控作用。,1构建基因表达载体(核心步骤),2将目的基因导入受体细胞,【拓展深化】 只有第三步将目的基因导入受体细胞不需碱基互补配对，其余三个步骤都涉及碱基互补配对。 工具酶只有两种：限制酶在操作程序1、2中用到且要求用同一种，目的是产生相同的黏性末端；DNA连接酶只在操作程序2中用到。 目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。转化的实质是目的基因整合到受体细胞染色体基因组中。,即时应用(随学随练，轻松夺冠) 2目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过鉴定与检测才能知道。下列属于目的基因检测和鉴定的是( ) 检测受体细胞中是否有目的基因 检测受体细胞中是否有致病基因 检测目的基因是否转录出了mRNA 检测目的基因是否翻译成蛋白质 A B C D 答案：C,命题视角剖析,基因工程的操作过程分析(2011年南京市质量检测)已知SARS是由一种RNA病毒感染所引起的疾病。SARS病毒表面的S蛋白是主要的病毒抗原，在SARS病人康复后的血清中有抗S蛋白的特异性抗体。某研究小组为了研制预防SARS病毒的疫苗，开展了前期研究工作，其简要的操作流程如下：,(1)实验步骤所代表的反应过程是_。 (2)步骤构建重组表达载体A和重组表达载体B必须使用限制酶和_酶，后者的作用是将用限制酶切割的_和_连接起来。 (3)如果省略步骤 而将大量扩增的S蛋白基因直接导入大肠杆菌，一般情况下，不能得到表达的S蛋白，其原因是S蛋白基因在大肠杆菌中不能_，也不能_。,(4)为了检验步骤所表达的S蛋白是否与病毒S蛋白有相同的免疫反应特征，可用_与_进行抗原抗体特异性反应实验，从而得出结论。 (5)步骤和的结果相比，原核细胞表达的S蛋白与真核细胞表达的S蛋白的氨基酸序列_(填“相同”或“不相同”)，根本原因是_ _。,【尝试解答】 (1)逆转录 (2)DNA连接 载体 S蛋白基因 (3)复制 合成S蛋白基因的mRNA (4)大肠杆菌中表达的S蛋白 SARS康复病人血清 (5)相同 表达蛋白质所用的基因相同 【解析】 (1)利用RNA获取DNA，一般采用逆转录的方法，在这一过程中需要逆转录酶； (2)目的基因与载体结合，先用限制酶在目的基因和载体上切出相同的黏性末端，将目的基因片段插入载体的切口处，再加入适量的DNA连接酶，将黏性末端连接起来；,(3)选择性扩增后得到的含有遗传信息的DNA片段(S蛋白基因)，直接导入大肠杆菌细胞内，在不与其DNA整合的情况下，不进行复制和转录，得不到相应的蛋白质； (4)通过大肠杆菌合成的S蛋白，结构和功能可能会发生变化，可与人体内产生的抗S蛋白的抗体进行抗原抗体特异性反应，以此进行检测； (5)各种生物都共用一套遗传密码，因此转入相同的目的基因，表达出的蛋白质一般应相同。,基因工程的基本工具 (1)获取目的基因时要保证其完整性。 (2)质粒的切割要保证标记基因的完整性。 (3)非受精卵的植物组织细胞作为受体细胞时需用植物组织培养技术。,(2010年高考江苏卷)下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题：,(1)一个图1所示的质粒分子经Sma切割前后，分别含有_个游离的磷酸基团。 (2)若对图中质粒进行改造，插入的Sma酶切位点越多，质粒的热稳定性越_。 (3)用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用Sma 切割，原因是_。,(4)与只使用EcoR相比较，使用BamH和Hind 两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止_。 (5)为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入_酶。 (6)重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了_。 (7)为了从cDNA文库中分离获取蔗糖转运蛋白基因，将重组质粒导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体，然后在_的培养基中培养，以完成目的基因表达的初步检测。,【尝试解答】 (1)0、2 (2)高 (3)Sma会破坏质粒的抗性基因、外源DNA中的目的基因 (4)质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化 (5)DNA连接 (6)鉴别和筛选含有目的基因的细胞 (7)蔗糖为唯一含碳营养物质 【解析】 环状DNA分子中磷酸全部参与形成磷酸二酯键，被Sma 限制酶切开后相当于一个正常的DNA分子，每个DNA分子单链各含有一个游离的磷酸基团；AT碱基对有两个氢键，而GC碱基对有三个氢键，GC碱基对含量越多，热稳定性越高；,从图中读出：Sma I限制酶破坏目的基因和标记基因；用BamHI和Hind 两种不同的限制酶处理，形成不同的黏性末端，能有效防止只用一种限制酶形成的相同的黏性末端的质粒或目的基因相互连接、环状化；将质粒与目的基因“缝合”应用DNA连接酶进行处理；标记基因的作用在于鉴别和筛选含有目的基因的细胞；大肠杆菌突变体丧失吸收蔗糖的能力，不能在只有蔗糖为碳源的选择培养基上存活，所以可以用该种选择培养基对导入的蔗糖转运蛋白基因是否表达进行初步检测。,易混淆的几种酶,自我挑战如图为DNA分子的某一片段，其中分别表示某种酶的作用部位，则相应的酶依次是( ) ADNA连接酶、限制酶、解旋酶 B限制酶、解旋酶、DNA连接酶 C解旋酶、限制酶、DNA连接酶 D限制酶、DNA连接酶、解旋酶 【尝试解答】 _C_,