资源预览内容
第1页 / 共10页
第2页 / 共10页
第3页 / 共10页
第4页 / 共10页
第5页 / 共10页
第6页 / 共10页
第7页 / 共10页
第8页 / 共10页
第9页 / 共10页
第10页 / 共10页
亲,该文档总共10页全部预览完了,如果喜欢就下载吧!
资源描述
实验五 神经元的培养,一、实验目的,1、学习分辨subventricular zone (SVZ)区,掌握神经元原代培养技术。 2、了解神经元的培养条件,认识神经元的形态并学会判断神经元的生长状态。 3、学习免疫荧光染色技术并拍照进行神经元的鉴定。,二、实验材料、试剂与器材,1、高糖DMEM、胎牛血清神经、基本培养基、B27、丙酮酸钠、L型谷氨酰胺、胰蛋白酶、EDTA、0.01% L-型多聚赖氨酸、二甲基亚砜、青霉素、链霉素、多聚甲醛、mouse anti-GFAP单克隆抗体、rabbit anti-NCAM单克隆抗体、FITC-III-Tubulin单克隆抗体、FITC标记山羊抗鼠二抗、FITC标记山羊抗兔二抗、Hoechest 33258。 2、细胞培养箱、微量移液器、倒置相差显微镜、解剖显微镜、细胞培养皿、脑膜镊、荧光显微镜、电子天平、pH计、离心机、超净工作台、电热恒温鼓风干燥箱、电热恒温水槽、超声波清洗机、立式压力蒸汽灭菌器。,三、实验原理,神经元是神经组织内高度分化的细胞,数量庞大,形态多样,结构复杂,是神经组织结构和功能单位 。 本实验神经元来自于海马区域,主要利用不同细胞差速贴壁的特点进行分离培养,同时对所得到的细胞进行形态学的观察和相关的免疫抗原反应鉴定。 神经元培养传统的有血清培养和无血清培养,血清成分复杂,会对海马区神经元的体外生长造成不良影响。无血清培养基可以相对纯化神经元。同时,无血清培养液构成成分清楚,有利于实验条件的稳定,利于研究特定因素对体外培养神经元的影响。,实验步骤: 1、神经元的分离与培养 取出生1-2 d的SD新生大鼠,断头法处死,取出全脑,解剖显微镜下切取脑室下区 (Subventricular Zone, SVZ),置于预冷的D- Hanks溶液中,巴氏吸管机械打散后加入0.25%胰蛋白酶,37下消化15 min,1 ml血清终止消化后,D-Hanks液1000转/分离心2次,H-DMEM1000转/分离心1次,用SVZ细胞培养液吹打混匀,制成单细胞悬液,记数细胞活力后,按2.5104/ml密度接种于35 mm培养皿中,于37、5%CO2细胞培养箱中静置培养,每三天换液。,Differential interference contrast (DIC)下的体外培养到第6 d时的神经元细胞形态,bar=100 m,2、神经元的鉴定 将体外生长10天左右的神经元吸出培养液后,0.01 M PBS(PH7.2)洗两次,每次5 min。吸去PBS,加入4%多聚甲醛,4冰箱固定过夜后吸去固定液,PBS洗三次,每次5 min。滴加用PBS + NaN3(0.02%)+ BSA(3%)+ TritonX-100(0.2%)稀释的鼠抗FITC-III-Tubulin IgG(1:200),4冰箱固定过夜后PBS洗三次,每次5 min,加入1 M Hoechst 33258室温孵育5 min,PBS洗两次,共5 min,最后50缓冲甘油(PBS配制)封片,荧光显微镜下观察阳性细胞。阴性对照采用PBS代替抗体,结果阴性。,体外培养到第6 d时的神经元细胞进行-III-Tubulin免疫荧光鉴定, H33258(蓝色)代表细胞核,bar=100 m,数据处理与统计分析: 所有的实验数据:包括一级分叉数,二级分叉数,分叉总长度等由Image J和Image pro plus计算。数据分析p0.05即认为有差异。 注意事项: 1、正确的切取SVZ区,切取的范围不要太大,脑膜、血管尽量剔除干净,以免杂细胞太多影响神经元的纯度。 2、切取SVZ区时速度要快,避免影响细胞活性。 3、所有的试剂使用前都要放在冰上预冷,以保持细胞活性。 4、培养神经元的培养瓶要提前用PLL包被好。,【思考题 】 1、SVZ区所处于什么位置?为什么要选取SVZ区作为神经元的来源? 2、培养基中添加的因子有何作用? 3、经过荧光染色以后,为什么阳性的神经元发绿光? 4、Hoechst 33258的作用是什么?,
网站客服QQ:2055934822
金锄头文库版权所有
经营许可证:蜀ICP备13022795号 | 川公网安备 51140202000112号