免疫学实验技术,主讲人：裴银辉 教授,免疫标记技术,基本概念抗原（antigen）：进入动物体内能刺激动物的免疫系统发生免疫应答，从而引起动物产生抗体或形成致敏淋巴细胞，并能和抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质分完全抗原和半抗原抗体(antibody)：抗原刺激动物免疫系统，由免疫系统产生分泌的能和相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白,第三讲,抗原的制备：颗粒抗原、半抗原、人工抗原抗体的制备：多克隆抗体、单克隆抗体、 基因工程抗体,第三讲,免疫学技术-抗原抗体反应,可对抗原或抗体进行定性、定量、定位的检测抗体抗原以非共价键结合不可见反应：几秒-几分钟可见反应：数分钟（小时、日）影响因素电解质温度酸碱度,第三章,免疫标记技术,酶联免疫法放射免疫法荧光免疫法其他,第三讲,免疫标记技术是用荧光素、放射性同位素、酶、铁蛋白、胶体金及化学(或生物)发光剂等作为追踪物，标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应荧光显微镜，射线测量仪，酶标检测仪，电子显微镜和发光免疫测定仪等精密仪器，对实验结果直接镜检观察或进行自动化测定敏感性、特异性、精确性及应用范围,抗原抗体反应酶催化反应 肉眼、光学显微镜、电子显微镜、分光光度计 特异、敏感 可以在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在微克、甚至纳克水平上对其进行定量。,酶免疫技术 Enzyme Immunoassay（EIA）,一、概述,酶免疫标记用于抗原检测,（一）基本原理,酶标记抗体或抗原： 抗体或抗原的免疫学反应特异性 酶活性酶是一种有机催化剂：使底物基质水解而呈色使供氢体由无色还原型变为有色氧化型 可用呈色反应显示酶的存在。很少量的酶即可导致大量的催化过程，所以极为敏感。,（二）常用的酶及其底物,酶活性高；具有抗原抗体共价结合的基团；标记后不影响酶活性及抗原、抗体反应性；产物易判定或测定；酶活性不受样品中其他成分的影响（用于均相测定的酶标抗原与抗体结合后酶活性出现抑制或激活）；无害；稳定，价廉、易得。常用酶 底物 显色 辣根过氧化物酶 邻苯二胺、H2O2 橙黄色 四甲基联苯胺、 H2O2 蓝色 碱性磷酸酶 对硝基本磷酸脂 黄色,（三）标记方法,酶结合物技术简单、产率高；不影响酶和抗体（抗原）的生物活性；所得酶标记物稳定；较少形成酶与酶、抗体与抗体、抗原与抗原的聚合物。,戊二醛交联法：抗原-戊二醛-酶改良过碘酸钠标记法：过碘酸钠氧化酶的羟基为醛基，再与抗体蛋白的氨基结合。HRP-CH2-NH-IgG,（四）酶标记物的纯化及鉴定,1、纯化 游离酶：增加非特异染色 游离抗原（抗体）：竞争降低特异性染色葡聚糖凝胶层析法 50%饱和硫酸铵沉淀提纯法,2、鉴定免疫活性鉴定：免疫电泳/双扩/ELISA酶标记率测定：分光光度法,（五）固相酶免疫测定仪（酶标仪）,比色 测定波长、吸光度范围、光学系统、检测速度、震板功能、温度控制、定性和定量的软件，自动洗板、温育、加样 450nm、492nm、620nm、630nm、650nm、405nm,（六）类型,酶免疫组织化学技术,酶免疫测定,均相酶免疫测定,异相酶免疫测定,固相酶免疫测定,液相酶免疫测定,高敏感、高特异，几乎所有可溶性抗原抗体系统均可用该法检测,酶免疫组织化学技术：检测组织或细胞中抗原或抗体 酶免疫测定：用酶标记抗原或抗体做标记物，检测液体样品中可溶性抗原或抗体含量的微量分析技术。 根据抗原抗体反应后是否需将结合和游离的酶标记物分离，分为均相和异相 均相：酶标抗原+非标记抗原+限量抗体，酶标记物发生抗原抗体反应后，酶活性减弱或增强。 异相：反应后，分离形成复合物的酶标记物并检测。根据是否采用固相材料以吸附抗原或抗体分为液相和固相。 液相：待测抗原+酶标抗原+抗体，一次性温育待测抗原+抗体，温育，加酶标抗原，温育 固相：固相预先吸附抗原或抗体，在其表面反应,(酶)免疫组织化学（免疫细胞化学）：指带显色剂（酶）标记的特异性抗体或抗原在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原或抗体进行定性、定位、定量测定的技术。免疫反应特异性 组织化学的可见性,二 、酶免疫组织化学技术 Enzyme Immunohistochemistry Technique（EIHCT）,免疫组化技术近年来得到迅速发展。50年代还仅限于荧光免疫组化技术，50年代以后逐渐发展建立起高度敏感，且更为实用的酶免疫组化技术。 荧光免疫组化技术局限性：荧光抗体染色标本不能长期保存，对组织细胞的细微结构分辨不清 酶免疫组化技术：能克服上述不足，且敏感性更高，对石蜡切片标本尤为适用，酶显色产物具有较高的电子密度，可用电镜观察。,步骤： 抗原的提取与纯化 免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体及纯化 标记抗体 标本处理 抗原抗体反应和呈色反应 显微镜观察,标本 取材新鲜、固定及时、形态保存良好、抗原性不被破坏活体组织切片或印片 各种体液、穿刺液（细胞沉淀涂片） 培养细胞,1 标本的固定与保存： 固定使细胞内蛋白凝固，终止胞内酶活化，防止细胞自溶，保存抗原性 固定剂：乙醇、丙酮、戊二醛等 切片：冰冻、石蜡 2 酶消化：打开固定过程中由于醛键形成而被封闭的抗原决定簇（胃蛋白酶等）,3 免疫染色 标记抗体与标本中抗原反应形成复合物，洗去未结合成分，直接镜检。,对照试验（control）： Positive：已知抗原阳性的切片 Negative：不含已知抗原的切片 空白对照：排除组织自发荧光、内源性酶、生物素等,4 结果观察染色 特异性染色 非特异性染色 显色部位 特定细胞或间质 细胞或间质均匀染色或更强 显色定位 特定，有结构性 无特定部位，无结构性 显色程度 同一部位呈不同 无分布规律，某一片程度显色 均匀着色,非特异性染色：非抗原抗体反应出现的阳性染色。 原因：非特异性蛋白吸附于高电荷的胶原或结缔组织上。 防止方法：采用与第二抗体相同来源的动物血清吸附封闭底物组织上的带电物质；2%牛或人白蛋白封闭。,免疫酶细胞化学技术,免疫组织化学染色,（二） EIHCT类型1、酶标记抗体免疫组化技术将酶通过交联剂结合在抗体（抗抗体）分子上，形成酶标记抗体（抗抗体），与标本中相应抗原或抗原抗体复合物反应后，再经酶对底物显色，对标本中抗原进行定性和定位。2、非标记抗体酶免疫组化技术用酶免疫动物制备抗酶抗体（Ab3），将酶与Ab3结合，然后用第二抗体（ Ab2）作桥， Ab2既可与Ab3 Fc段结合，又可与结合在组织抗原上的Ab1 Fc段结合。酶显色。,1、酶标记抗体免疫组化技术类型： （1）直接法：-Ag + Ab*E -Ag-Ab*E 优点：简单、快速、特异缺点：一种酶标抗体只能测一种抗原，敏感性较差 （2）间接法：-Ag + Ab1 + Ab2*E -Ag-Ab1-Ab2*E 优点：一种酶标抗体能测多种抗原，实用性敏感性较直接法好缺点：敏感性低于非标记抗体酶法与三步法,2、非标记抗体酶免疫组化技术类型： （1）酶桥法： -Ag +Ab1(兔源) +Ab2(羊抗兔)+ 抗-HRP(兔源) + HRP （2）PAP法：过氧化物酶（P）-抗过氧化物酶（AP），预先制成复合物 减少操作步骤 （3）双桥PAP法： -Ag-Ab1(兔源) -Ab2(羊抗兔)-PAP-Ab2(羊抗兔)-PAP 增加酶分子，提高敏感性 （4）APAAP法：用碱性磷酸酶代替过氧化物酶，建立的碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶法既可Ag，也可查Ab。避免了酶标抗体的缺点。,3、酶免疫电镜技术（Immune electron microscopy，IEM）用酶标抗体与组织或细胞抗原结合，显色后在电镜下观察。免疫反应特异性与电镜高分辨力结合。亚细胞水平和超微结构，高精确度、高灵敏度,示踪物：电子致密物质。Singer (1959)首创此项技术，使用铁蛋白标记。 30多年来，经过许多学者的不断改进和发展，除铁蛋白外，主要有过氧化物酶和胶体金。过氧化物酶分解DAB的产物为不溶性的棕色吩嗪衍生物，经过Os04处理后变黑，具有高电子密度，十分适合于电镜观察。而且HRP的分子量(40kDd)比铁蛋白(750kDa)将近小20倍，酶标抗体较易透过经适当处理后的组织细胞膜，能用于定位细胞内抗原。但酶反应产物的分辨率不如颗粒性标记物高(如铁蛋白，胶体金)。,检测方法：由标记抗体法，改进为应用双功能抗体法、搭桥法及PAP法等。,免疫电子显微镜技术,三、酶联免疫分析技术 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay （ELISA）,1971年瑞典学者Engvail和Perlmannn,荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，称为酶联免疫吸附试验。 简便、快速、敏感、特异、实验设备简单、应用范围广、无同位素污染,酶联免疫井,（一）基本原理,酶联免疫吸附试验是一种固相免疫测定技术。 先将抗体或抗原包被到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。 将待检样本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应 加入酶标抗体与免疫复合物结合，用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离的未结合成分 最后加入酶反应底物，根据底物被酶催化产生的颜色及其吸光度(A)值的大小进行定性或定量分析的方法。,根据检测目的和操作步骤不同： 双抗体夹心法 间接法 竞争法 捕获法 dot-ELISA BAS-ELISA,（二）类 型,双抗体夹心法,此法常用于测定抗原，适用于多价大分子抗原的检测，而不能用于测定半抗原等小分子物质。,间接法,此法是测定抗体最常用的方法。,间接法,竟争法,此法可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体。,此法用于血清中某种抗体亚型成分测定。以IgM测定为例：,捕获法,抗人IgM链抗体,样本 （IgM1、2）,抗人IgM链抗体,IgM1,特异抗原（Ag1）,抗人IgM链抗体,抗人IgM链抗体,IgM2,抗人IgM链抗体,IgM1,抗人IgM链抗体,IgM2,Ag1,Ab1*E,抗人IgM链抗体,IgM1,抗人IgM链抗体,IgM2,Ag1,Ab1*E,（三）技术要点,1 固相载体：与Ab或Ag有较高结合容量，结合稳定；可结合AgAb及亲和素或链酶素等大分子蛋白；生物大分子固化后应保持活性，活性基团朝向反应溶液；固相化方法简便快速经济。塑料：非共价或物理吸附。小试管、小珠、板条 微颗粒：化学耦联，结合容量大，均匀分散在液体中，反应快，可磁化，方便分离。 膜载体：硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜、尼龙膜，非共价结合，吸附力强,2 免疫吸附剂 指与固相载体结合的Ag或Ab。将Ag或Ab固相化的过程称包被（coating）。用1-5%牛血清白蛋白或5-20%小牛血清等结合包被后固相载体表面剩余的少量未吸附位点，为封闭（blocking）。共价、非共价PH、离子强度、温度、时间、浓度一般用PH9.6的碳酸盐缓冲液，4过夜或372-6h,3 包被抗原和酶标抗体最佳工作浓度包被抗原 包被抗体 酶标抗体浓度,载体：微孔膜 标记物：酶、各种有色微粒子（彩色胶乳、胶体金、胶体硒等）免疫渗滤试验：对穿流 免疫层析试验：对横流,四、膜载体的酶免疫测定 Membranced-Based Enzyme Immunoassay,（一）斑点-酶联免疫吸附试验（dot-ELISA ）,原理：似ELISA，但载体为硝酸纤维素（NC）膜。更灵敏、节约、简便，易保存 以检测抗体为例：,Ag,Ab1？,Ab2-E,