第六章 常用分子生物学技术,第一节 分子杂交技术,具有互补序列两条单链核酸分子在一定条件下 按碱基互补配对原则退火形成双链的过程。杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列，已知 核酸序列称探针。,在某些理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程。,二、DNA变性是双链解为单链的过程,双链间氢键的断裂！,2、DNA变性的本质,1、DNA变性的概念,DNA变性曲线 AT区先解链 GC区后解链 阶梯式曲线,DNA变性的动态变化过程,核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex) 。,分子杂交,核酸分子杂交,探针技术,探针 (probe) 一小段用同位素、生物素或荧光染料标标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。,一、Southern印迹,此技术由Southern 1975年首先设计。被检测对象为DNA。,带有DNA片段的凝胶,Southern 印迹杂交的技术流程,从凝胶上转移DNA,二、Northern 印迹,应用DNA探针检测特异mRNA的一种杂交技术，主要用于分析mRNA的转录或mRNA分子大小。其方法类似于Southern印迹杂交。,三、Western 印迹,将待检测蛋白质（或酶）经PAGE电泳并染色后，转移到滤膜上固定，再用“抗体-抗原”免疫反应或“DNA-protein”结合反应鉴别滤膜上的蛋白质。,三种 印迹比较,三种印迹技术的比较,四、原位杂交 (in situ hybridization),1、定义： 将标记探针与细胞或组织中核酸按碱基配对原则进行特异性杂交，并应用组织化学或免疫组织化学方法在显微镜下进行细胞内定位或基因表达的检测技术称原位杂交（hybridization in situ)。 2、操作步骤： 载片的清洁与处理；组织与细胞的固定；探针； 湿盒,原位杂交,五、生物芯片chip,生物芯片（biochip）是近年来在生命科学领域中迅速发展起来的一项高新技术，主要是指通过微加工技术和微电子技术在固体芯片表面构建的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、DNA及其他生物组分的准确、快速与大信息量的检测。,1、生物芯片技术的特点,2、生物芯片使用步骤,芯片制作,把探针固定于载体表面,样品处理,目标分子富集,分子间的杂交,结果检测与数据分析,基因芯片扫描结果,不同的颜色代表一个探针点杂交上的带荧光标记的核酸分子数的差异。红黄绿兰紫,3、生物芯片分类,（1）基因芯片 （2）蛋白质芯片 （3）细胞芯片 （4）组织芯片,基因芯片概念：基因芯片，也叫DNA芯片，是将大量特定序列的DNA片段（分子探针）有序地固定在经过处理后的尼龙膜、玻璃片、硅片等支持物上 ，从而能快速、准确地对大量DNA分子序列进行测定和分析的一种类似电脑的芯片。 原理：利用碱基的互补配对原则（DNA分子杂交） 材料：分子探针，尼龙膜，玻璃片，硅片,可在基因组水平进行基因表达和发现研究、突变、序列测定等，已方泛应用于基因组研究和人类疾病的诊断等多领域。,4、基因芯片应用,5、制作基因芯片的大致步骤,表达芯片的制备检测流程,应用基因微矩阵芯片研究宫颈癌相关基因表达,DNA微点阵已广泛和流行的用于疾病诊断、基因组比较、以及新型癌症的分类。,第二节 目的基因制备技术,Kary Mullis research scientist in the 1980s at a California biotechnology company called Cetus co-winner of 1993 Nobel Prize,一、聚合酶链式反应（PCR）,（一）PCR技术发展简史,PCR技术最早由美国Cetus公司人类遗传研究室Kary Mullis及同事于1985年发现并研制成功的；最早的应用报道是Saiki等1985年将PCR技术应用于-珠蛋白基因扩增和镰刀状红细胞贫血的产前诊断。随后使用了1976年Chien等分离的热稳定性Taq DNA聚合酶，使PCR操作大为简化，并使PCR自动化成为可能；1987年Kary Mullis等完成了自动化操作装置，使PCR进行实用阶段。,1、PCR的基本原理,DNA半保留复制机理,聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）,（二）PCR技术的基本原理和操作,模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+,2、PCR的基本成份,5,Primer 1,5,Primer 2,5,5,Template DNA,3、PCR的基本操作,PCR产物以指数形式增加，即Y = 2n (n 为循环次数),是不是循环次数越多越好？,PCR扩增的平台效应,4、PCR的反应步骤,5、引物设计,（1) 序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。 （2）引物长度以15-40 bp为宜。 （3）碱基尽可能随机分布。 （4）引物内部避免形成二级结构。 （5）两引物间避免有互补序列。 （6）引物3端为关键碱基；5端无严格限制,6、PCR技术的优点,特异性强 灵敏度高 操作简单、省时 对待检原始材料质量要求低 高效率的基因扩增技术,PCR技术的特点：扩增特异的DNA片段,1、目的基因的克隆 2、基因的体外突变 3、DNA和RNA的微量分析 4、DNA序列测定 5、基因突变分析,（三）PCR的主要应用,实时PCR技术原理,目的：扩增产生特异长度的单链DNA。 方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.010.5M,关键是限制性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板；制备杂交探针； 基因组DNA结构功能的研究,不对称PCR,高浓度引物,低浓度引物,反向PCR (reverse PCR),用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段，对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。,未知序列,未知序列,已知序列,已知序列,未知序列,未知序列,限制酶,限制酶,连接酶,多重PCR,在同一PCR体系中加入若干对PCR引物，如果这些引物的退火温度相近，并且所覆盖的区域不重叠，这样的反应体系可同时扩增多个DNA片段。 当基因的外显子发生缺失时，根据条带缺失的数目和引物相应的位置，可判断基因中哪一个或哪几个扩增部位发生缺失。,电泳,引物,1,2,3,4,1,2,3,4,DMD：人类肌营养不良基因,A：无外显子8,12,17,19对应条带,说明病人外显子819缺失,B：病人A中未扩增外显子带的强度为C的一半,提示为区域缺失携带者,C：正常人DMD基因外显子的一般扩增形式,多重PCR检测DMD基因缺失,DMD基因外显子缺失的检测,在同一反应体系中加入多对引物，同时扩增一份DNA样本中多个不同序列的靶片段。,LP-PCR（Labelled primers),利用同位素、荧光素等对引物进行标记, 用以直观地检测目的基因。 特别适合大量临床标本的基因诊断 可同时检测多种基因成分,标记引物,观察,PCR产物,逆转录PCR（RT-PCR）,以细胞内总RNA或mRNA为材料进行体外扩增的技术。 主要用于克隆 cDNA、合成cDNA探针，检测RNA病毒、分析基因表达等,逆转录生成cDNA方式： 以随机进行的PCR扩增所需的下游引物作为逆转录反应的引物以oligo(dT)作为引物，mRNA3末端polyA尾与之互补以人工合成的随机序列六核苷酸混合物作为引物，进行扩增。,reverse transcription,逆转录酶,聚合酶,mRNA,cDNA,杂化双链,PCR扩增,用目的基因上的一段DNA做成探针与文库中的DNA作核酸杂交，从基因文库中“钓出”有目的基因的克隆。,二、cDNA文库cDNA library,基因组DNA文库 (genomic DNA library) cDNA文库 (cDNA library),基因文库 (gene library),是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。,基因组DNA文库,从cDNA文库获取目的基因,由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。,三、化学合成,第三节 基因敲除技术,基因敲除（gene knock out）又称基因剔除，或基因打靶 （gene targeting）是指通过DNA定点同源重组，定向改变基因组中的某一特定基因，使机体特定基因失活或缺失，从而研究此基因的功能的一种分子生物学技术。,转抗凝血酶素V基因、转-干扰素基因羊。,如何敲除其胰岛素基因，成为糖病模型？,猴的基因编码与人类只有1%的差别，通过转基因猴，可以研究各种疾病对人的影响，并开发出相应的治疗方法。如引进老年性痴呆病的基因，加快针对这种疾病疫苗的开发研究。还可引进糖尿病、乳腺癌、帕金森氏症等基因，为人类最终战胜社些疾病提供帮助。,由于胚胎干细胞的这种特殊性，ES细胞基因打靶技术已被广泛地应用于建立转基因动物之中。从80年代到90年代初，小鼠ES细胞基因打靶技术已发展到成熟阶段。 1984年，Bradly等成功地用显微注射法将ES细胞移入囊胚腔，并移植回假孕母鼠，获得生殖系嵌合体，再适当交配，获得源于ES细胞系纯系小鼠。,基因敲除的发展历程,此实验首次证实体外培养的ES细胞能在体内分化发育成生殖系嵌合体并可获得小鼠纯合体子代。1987年，人们利用ES细胞技术建立了次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(hprt)基因敲除(Gene knockout)的动物模型。 此后，这项技术得到了普遍应用和长足发展。,一、基因敲除的一般原理,基因敲除是80年代后半期应用DNA 同源重组原理发展起来的。80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到1987年，Thompson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型。,knock-out ：the gene of interest is disrupted,同源重组,抗性选择,RB,DT-A,DT-A,hpt,En,LB,Waxy,重组,整合,Waxy,hpt,En,Waxy,重组,intron1,表达载体,受体基因组,打靶结果,基因打靶（gene targeting）,发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologous recombination)，又称基本重组（general recombination）。通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。,同源重组是最基本的DNA重组方式,Holliday模型的4个关键步骤：,两个同源染色体DNA排列整齐；,一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成Holliday中间体；,通过分支移动产生异源双链DNA；,Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为：,Holiday中间体,5,片段重组体,拼接重组体,二、基因敲除载体构建,1、获得目的基因的同源片段。 2、从重组质粒中切除目的基因同源片段的大部分同源DNA序列，只留部分序列在线性质粒载体的两端。 3、将新霉素抗性基因（neo）克隆到带有同源序列的线性质粒中。 4、在目的基因同源序列的外侧线性化重组质粒载体，引入疱疹病毒胸苷激酶（HSV-tk）,1、插入性载体(gene-insertion vector)： 断裂位点位于同源序列区域内，选择基因紧邻同源目的序列。基因重组时整个载体整合到染色体靶位点上，载体 DNA 同源序列与染色体靶位点进行一次同源重组。,