乙型肝炎病毒的异质性 及临床意义,成 军 博士、教授北京地坛医院,HBV的感染过程,第一部分 乙型肝炎病毒的血清型,1 决定因素 乙型肝炎病毒的血清型，由膜主蛋白序列来决定。 2 亲水结构区 HBsAg有两个亲水区：32-76 aa和110-156 aa。HBsAg亲水赖氨酸改变，抗原活性消失。 3 共同决定簇 139-147 aa是共同簇抗原a必需的最小序列。,乙型肝炎病毒的血清学分型,1 排斥决定簇 主蛋白还携带两对相互排斥的亚型决定簇d/y （122-134 aa指令d/y决定簇）和w/r （159-160 aa指令w/r决定簇）。 2 四个主要亚型 组成4个主要亚型：adw、adr、ayw和ayr。,四个主要亚型,除了4个主要亚型外，还有adyr、adwr、adyw/aywr和adywr等复合亚型。不同亚型在外膜蛋白的前-S区序列和全基因组序列亦有相应的差异。,复合亚型,第二部分 乙型肝炎病毒的基因型,HBV基因型的定义,分型方法是根据HBsAg主蛋白基因或全基因组核苷酸序列差异性进行的基因型分型，差异大于8%即被确定为另一基因型，按照这种分型方法，将HBV分为6种基因型，分别命名为A-F型，另有学者新定义了G、H型，尚待确定。,国内流行病学资料,国内主要的基因型为B、C两型，台湾省的研究资料提示除E型外，其他基因型均可在华人HBV感染者中检出，B和C型占患者人群的85%。,HBV 的异质性 基因型,基因型 * 地理分布A 北欧、西欧、美国、非洲B 中国、印度尼西亚、越南C 中国、越南、朝鲜、日本D 地中海区、中东、印度E 西非F 美国（印地安拿人）、波利尼西亚G 欧洲、美国* 根据 HBV 全序列中核苷酸差异 8%Chu CJ et al. Hepatology 2002; 35(5):1274,第三部分 乙型肝炎病毒基因准种的特点,问 题 不同的慢性乙型肝炎患者之间血清中乙型肝炎病毒基因序列是不同的，因此可以根据序列的差别分成不同的血清型（adr、ayw、adw 等），也可以分成不同的基因型（A、B、C、D、E、F、G、H）。 问：同一个患者血液中不同的乙型肝炎病毒之间其基因序列是否相同？ 答：相同！或 不同！,型与准种,基因型 （不同个体之间）血清型 （不同个体之间）准 种 （单一个体）,乙型肝炎病毒准种的定义 乙型肝炎病毒在长期复制过程中，由于逆转录过程其多聚酶缺乏严格的校正机制，从而产生自发点突变，造成子代病毒基因序列之间的微小差别，因而血清中的乙型肝炎病毒基因序列是不同的。这种差别一般小于全长基因组的5%。 有微小基因序列差别、但序列十分相近的乙型肝炎病毒组成的病毒群，这一病毒群时刻处于动态变化之中，乙型肝炎病毒的这种存在状态称为“准种”。 英文：quasispecies,为什么以前没有注意？ 方法比较,既往方案： 收集血清 提取血清中HBV DNA 设计重叠PCR引物 PCR扩增 产物直接测序 （单一克隆序列）,本研究方案 收集血清 提取血清中HBV DNA 设计PCR引物 PCR扩增 TA克隆入质粒载体中 随机选择单克隆测序 （多个克隆序列）,S基因准种的特点 （前-S1、前-S2、S）,Protocol of Human Somatic Gene Therapy,S 基因全长 PCR, 1400 bp,1 2 3 4 M 5 6 7,1 400 bp,HBV全S基因RFLP结果,遗传树分析,E853-A3,E845-A12,E845-B4,E845-A16,E845-A8,Renbao Gan,N19 E5,N19 A3,N19 A8,N19 E19,EJ1 B13,EJ1 A4,E67 B5,E67 A1,E67 A8,E67 B1 E67 B8,N19 E5,EJ1 B6 EJ1 A12,EJ1 B16,HBV准种特点分析 HBV DNA S RegionHBV DNA X RegionHBV DNA P RegionHBV DNA C RegionHBV DNA Pre-C 区HBV DNA 全长 HBV DNA ,基因准种的 个体化特点,HBsAg氨基酸序列,RT702 A3 MENTT-LFGGA-VPFAQWFAG- RT702A14 MENTT-LFGGA-VPFAQWFAG- RT702 B3 MENTT-LFGGA-VPFAQWFAG- RT702A10 MENTT-LFGGA-VPFAQWFAG- RT522 B7 MESTT-LFGGA-VPFVQWFVG- RT522 A5 MESTT-LFGGA-VPFVQWFVG- RT522B11 MESTT-LFGGA-VPFVQWFVG- RT XJ A2 MENTT-LFGEA-VPFVQWFVG- RT XJ A6 MENTT-LFGEA-VPFVQ*FVG- RT XJ B5 MENTT-LFGEA-VPFVQWFVG- RT XJ C4 MENTT-LFGEA-VPFVQWFVG-,变异的一些特点（逆转录酶区）,RT702 A3 -SSNLSWLS-SHPIVLGF-VIGSWGTLPQEHIVLKIK- RT702A14 -SSNLSWLS-SHPIVLGF-VIGSWGTLPQEHIVLKIK- RT702 B3 -SSNLSWLS-SHPIVLGF-VIGSWGTLPQEHIVLKIK- RT702A10 -SSNLSWLS-SHPIVLGF-VIGSWGTLPQEHIVLKIK- RT522 B7 -SSNLTWLS-SHPIILGF-VIGSWGTLPQEHIVLKLK- RT522 A5 -SSNLTWLS-SHPIILGF-VIGSWGTLPQEHIVLKLK- RT522B11 -SSNLTWLS-SHPIILGF-VIGSWGTLPQEHIVLKLK- RT XJ A2 -SSNLSWLS-SHPIILGF-VIGCWGTLPQEHIVLKIK- RT XJ A6 -SSNLSWLS-SHPIILGF-VIGCWGTLPQEHIVLKIK- RT XJ B5 -SSNLSWLS-SHPIILGF-VIGCWGTLPQEHIVLKIK- RT XJ C4 -SSNLSWLS-SHPIILGF-VIGCWGTLPQEHIVLKIK-,前-S2基因 缺失突变的研究,线 索： S基因研究中发现前-S2区多个缺失突变株的存在,HBV在慢性患者人群中的准种现象,前-S2区缺失突变分析,总数 无缺失 缺失百分比 HBeAg 阳性 36 23 13（36%） 抗-HBe 阳性 15 1 14（93%）合计 51 24 27（52%） ,前-S2区缺失突变位点分析 位点 范围 702-4 nt 43-66 24 bp ZH-A6 nt 52-66 15 bp ZH-B4 nt 37-66 30 bp ZH-B12 nt 37-66 30 bp N314-5 nt 25-66 42 bp N314-7 nt 25-66 42 bp 811-B12 nt 52-66 15 bp ,不同病毒株突变位点adr MQWNSTTFHQALLDPRVRGLYFPAGGSSSGTVNPVPTTASPISSIFSRTGDPAPN 702-1 -A-I-H 702-4 -A-I- 702-9 -G-A-T-I- 702-10 -G-A-T-I- 314-1 -T-Q-L-I- 314-5 -L- 314-7 -L- 314-9 -T-Q- ZH-A6 -Q- ZH-B4 - ZH-B6 - ZH-B11 - ZH-B12 - 142-A3 - 142-A7 - 142-A8 -H 811-A7 - 811-A8 - 811-B12 -,