第五章 分子生物学研究方法 DNA、RNA及蛋白质操作技术,5.1 重组DNA技术回顾 三大成就： 1、20世纪40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题； （1928 Frederick Griffith &1944 Oswald Avery Transformation of Streptococcus pneumoniae）,2、50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半 保留复制机制, 解决了基因的自我复制和世代交替问题。,但是：如果没有分离和富集单一DNA分子的技术，科学家就无法对这类物质进行直接的生化分析。,仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和DNA连接酶进行DNA的切割和重组远不能满足基因研究的需要。 DNA片段在体外不具备自我复制能力，要想得到足够量和足够纯度的DNA，必须将它们连接到具备自主复制能力的DNA分子上（载体上），并转入寄主细胞中进行繁殖。这就是基因克隆或分子克隆 。,1970年，Mandel和Higa发现，大肠杆菌细胞经适量氯化钙处理后，能有效地吸收噬菌体DNA。 1972年，Cohen等人又报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细胞同样能够摄取质粒DNA。 从此，大肠杆菌就成了分子克隆中最常用的转化受体。,5.2 DNA基本操作技术,5.2.1 核酸的凝胶电泳,自从琼脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段，也是现在通用的许多分子生物学研究方法。 DNA分型、DNA核苷酸序列分析、限制性内切酶片段分析以及限制酶切作图等的技术基础，受到科学界的高度重视。,1、基本原理,一种分子在电场中，它会以一定的速度移向适当的电极。把这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率，它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。电场强度越大，电泳分子所携带的净电荷数量越多，其迁移的速度越快，反之则较慢。 由于在电泳中用无反应活性的稳定的支持介质，如琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶等，故电泳的迁移率与分子的摩擦系数成反比。,图3-2：以禽巴氏杆菌C48-3株基因组DNA为模板PCR扩增的 cp39基因 M：DNA marker of DL1500；1：PCR产物； 2：阴性对照。 M：标准DNA-DL2000；1：PCR products; 2：Negative control.,图2-2：体内外培养禽巴氏杆菌荚膜蛋白的SDS-PAGE结构 M：低分子量标准蛋白；1-4：体外培养的X-73，C48-3， P-1059和C51-3株荚膜蛋白；5-8：体内培养的巴氏杆菌X-73，C48-3，P-1059和C51-3株荚膜蛋白。,脉冲电场凝胶电泳 （pulsed-field gel electrophoresis，PFGE) 这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的。DNA分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间取决于它的大小。 该方法可分离长至5Mb的DNA分子。严格说来，应叫交替电场凝胶电泳。,5.2.2 细菌转化与目标DNA分子的增殖 细菌转化（transformation） 一种细菌菌株由于捕获了来自供体菌株的DNA而导致性状特征改变的过程。提供转化DNA的菌株叫做供体菌，接受转化DNA的细菌菌株则被称为受体菌。,