,生物技术核心课程,Principles of Genetic Engineering 基 因 工 程 原 理,生命学院遗传与基因工程教研室 余丽芸 教授博士,基因工程原理纲要,第一讲 基因工程概论 第二讲 基因工程的主要技术 第三讲 基因工程的酶学基础 第四讲 基因克隆的载体与受体 第五讲 目的基因的克隆 第六讲 克隆基因的分离 第七讲 新基因的功能鉴定 第八讲 克隆基因的表达与调控,第四讲 基因克隆的载体与受体,vectors,基因克隆过程,？vectors 本质？,在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子叫载体。,1. 载体 (Vectors),A vehicle that transports the gene into a host cell, which is usually a bacterium.,载体的本质是DNA。经过人工构建的载体，不但能与外源基因相连，导入受体细胞，而且还能利用本身的调控系统使外源基因在新的细胞中复制。,1 运送外源基因高效转入受体细胞 2 为外源基因提供复制能力或整合能力 3 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件 Within the host cell the vector multiplies, producing numerous identical copies not only of itself but also of the gene that it carries.,载体的功能：,1 运送外源基因高效转入受体细胞 2 为外源基因提供复制能力或整合能力 3 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件 Within the host cell the vector multiplies, producing numerous identical copies not only of itself but also of the gene that it carries.,载体的功能：,（1）在宿主细胞内能独立复制。 replicate independently in host cell （2）有选择性标记。 selectable marker,（3）有一段多克隆位点。 multiple cloning sites,2. 基因工程对载体的要求,外源DNA插入其中不影响载体的复制。,（4）分子量小，拷贝数多。 Low molecules and multiple copies （5）容易从宿主细胞中分离纯化。 Easy isolation and purification from host cells.,host cell,origin of replication,replicate independently,抗Amp,Host bacterium,Amp growth medium,antibiotic selectable marker,Amp,Tet,Plasmid,基因工程中常用的载体有5类：,3. 载体的种类,质粒（plasmid） 单链DNA噬菌体M13 噬菌体的衍生物 柯斯质粒（cosmid） 动物病毒（virus）,第一节 质粒载体,一、质粒（plasmid）,Plasmids, which are small circles of DNA found in bacteria and some other organisms. Plasmids can replicate indenendently in the host cell chromosome.,质粒作为一种裸露的、比病毒更简单的、有自主复制能力的DNA分子，是处于生命与非生命的分界线上。,第一节 质粒载体,一、质粒（plasmid）,是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。Plasimds are circular molecules of DNA that lead an independent existence in the bacterial cell, replication independent.,存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。,大肠杆菌的质粒,（1）分子小：,1. 质粒的一般生物学特性,1200 kb,（2）编码基因少：,23个中等大小的蛋白质。,（3）环形状：,双链环状DNA。,（酵母的“杀伤质粒”是RNA）。,如抗菌素抗性、代谢特征等，赋予细菌一些额外的特性（非必须）。,（4）质粒的空间构型：, 共价闭合环状DNA（cccDNA),呈超螺旋（SC）（super coil）,Covalent close circular DNA, 线形DNA （ linear ，lDNA）,一条链上有一至数个缺口。, 开环DNA（ open circular， ocDNA）,（5）质粒空间构型与电泳速率,同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同：,scDNA最快、l DNA次之、ocDNA最慢。,SC,OC,L,二、质粒的类型,在大肠杆菌中的质粒，可以分为：,接合型质粒:,非接合型质粒,能自我转移,不能自我转移,Depending upon whether or not plasimd DNA carry a set of transfer genes,called the tra genes, which promote bacterial conjugation , Plasimds can be categorized.,除了带有自我复制所必需的遗传信息外还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。,如：F质粒（性质粒、或F因子）：,甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中。,又叫自我转移型质粒。,1. 接合型质粒conjugative plasmid ：,不符合基因工程的安全要求。,Plasmid transfer by conjugation between bacterial cells.,大肠杆菌接合（conjunction）,2. 非接合型质粒non-conjugative plasmid ：,虽然带有自我复制所必需的遗传信息，但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因此不能从一个细胞转移到另一个细胞。,（1）R质粒（抗性质粒）：,带有一种或数种抗生素抗性基因，使寄主获得同样的抗生素抗性性状（resistance）。,符合基因工程的安全要求。,带有控制大肠杆菌素（colicin）合成的基因。,（2）Col质粒：,大肠杆菌素对不带Col质粒的大肠杆菌有毒。,Col质粒或R质粒如果带有转移基因，也可以成为接合型质粒。,但如果在其寄主细胞中存在着一种接合型的质粒，非接合型质粒也可以被转移的。这种由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程，叫做质粒的迁移作用。 A non-conjugative plasmid may, under some circumstances, be cotransferred along with a conjugative plasmid when both are present in the same cell.,质粒的拷贝数 ：是指每条细菌染色体所平均具有的质粒DNA分子的数目。 The copy number refers to the number of molecules of an individual plasmid that are normally found in a single bacterial cell.,copy number of a plasmid ： （1） low copy plasmid ：1-3 copy number of molecules of an individual plasmid in a cell， stringent plasmid 。 （2） multiple copies plasmid：10-60 copies in a cell , relaxed plasmid 。,Generally speaking, a useful cloning vehicle needs to be present in the cell in multiple copies so that large quantities of the recombinant DNA molecule can be obtained.,conjugative plasmid: high molecular weight，limited number of copies per cell，stringent plasmids。,non-conjugative plasmid : low molecular weight ，multiple copies per cell，relaxed plasmids。,三、质粒的复制类型,1. 严紧型质粒（stringent plasmid）,拷贝数少，只有13份拷贝。,2. 松弛型质粒（relaxed plasmid）,拷贝数多，有1060份拷贝。,（接合型质粒分子量大，一般属严紧型）。,（非接合型质粒分子量小，一般属松弛型）。,在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能在同一宿主细胞中稳定地共存，这一现象称为质粒的不亲和性(plasmid incompatibility)，也称质粒的不相容性。 亲缘关系较近的不同质粒进入同一细胞后，必定有一种质粒在细胞的增殖过程中被逐渐排斥(稀释)掉，称这些质粒间是不相容的。,compatibility,彼此不相容的质粒属于同一个不亲和群(incompatibility group)。而彼此能够共存的亲和质粒，则属于不同的不亲和群。这是因为它们的复制机制相同。 现已鉴别出大肠杆菌质粒有25个以上的不亲和群，它们之间是相容的，而同一个不亲和群内的质粒是不相容的。,质粒的不亲和性（序）,To be able to coexist in the same cell, different plasmids must be compatible. If two plasmids are incompatible then one or the other will be quite rapidly lost from the cell. Different types of plasmid can therefore be assigned to different incompatibility groups on the basis of whether or not they can coexist, and plasmids from a single incompatibility group are often related to each other in various ways.,（1）分子量大，拷贝数低,四、质粒载体的构建,1. 天然质粒的局限性,第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，分子长 9.1 kb。,但只有一个EcoR I切点充当克隆位点，Tetr 作为筛选标志。,ColE1质粒的筛选标志是大肠杆菌素E1（colicin E1）。,（2）筛选标志不理想,可以通过插入失活筛选。但细菌群体容易自发突变出抗colicin E1的细胞.,colicin E1能杀死不含ColE1 质粒的菌，形成“噬菌斑”。,唯一的克隆位点 EcoR I 正好位于这个基因的内部。,ColE1,（1） 具有复制起点（ORI）,2. 质粒载体必须具备的基本条件,（2）具有抗菌素抗性基因,（3）若干限制性内切酶的单一位点：,是筛选的标志。理想的载体应该有两种抗菌素抗性基因。,用来插入外源DNA片断。且插入后不影响复制功能。,