实验六 PCR反应,一、实验目的了解PCR的基本原理，掌握PCR的基本操作技术。 二、实验原理PCR技术是通过模拟体内DNA复制的方式，在体外选择性地将DNA某个特殊区域扩增出来的技术。 PCR的过程： 高温变性：将反应体系置于高温下变性，使模板双链DNA解链为两条单链 低温退火：引物与模板链结合，形成部分双链DNA 中温延伸：Taq DNA聚合酶使引物从5端向3端延伸，4种dNTP掺入合成新的DNA互补链反复进行这种变性、退火和聚合反应循环，可使两端引物限定范围内的DNA序列以指数形式扩增。,三、实验材料实验二所提质粒： pET32-CaM5四、试剂 1. 10x PCR buffer 、rTaq 酶 2. dNTP mixtures：dATP, dTTP, dGTP, dCTP 各2.5mM 3. 前向引物(10uM)：5-CGCGAATTCATGGCAGATCAGCTCACCGATGATC-3 4. 反向引物(10uM)：5-AGAGCGGCCGCCTTTGCCATCATAACTTTGACAAA-3 5. 1.0% 琼脂糖凝胶,以pET32-CaM5为模板，理论上能扩增出一条443bp的DNA条带,ATGGCAGATCAGCTCACCGATGATCAGATCTCTGAGTTCAAGGAAGCTTTTAGCCTTTTCGACAAAGACGGAGATGGTTGCATCACAACGAAAGAGCTAGGAACAGTGATGAGATCATTAGGTCAAAATCCAACAGAAGCAGAGTTACAAGATATGATAAACGAAGTAGATGCTGATGGTAACGGAACCATAGACTTCCCTGAGTTTCTGAACCTAATGGCTAGGAAGATGAAGGACACTGACTCTGAAGAAGAGCTCAAAGAAGCTTTCAGGGTTTTCGATAAGGACCAGAACGGTTTCATCTCGGCAGCTGAGTTAAGACATGTAATGACAAATCTTGGTGAGAAGTTAACTGATGAAGAAGTTGATGAGATGATCAAAGAAGCTGATGTTGATGGAGATGGTCAGATCAATTATGAAGAGTTTGTCAAAGTTATGATGGCAAAG,正向引物（Forward primer CaM5-F）EcoRI 5-CGCGAATTCATGGCAGATCAGCTCACCGATGATC-3 （与ATGGCAGATCAGCTCACCGATGATC相同） Tm=64反向引物（Reverse primer CaM5-R）：NotI 5-AGAGCGGCCGCCTTTGCCATCATAACTTTGACAAA-3 （与TTTGTCAAAGTTATGATGGCAAAG互补）Tm=64,五、实验步骤 1、PCR反应混合液的配制 (50l)10 x PCR buffer 5ldNTP mixture 4l前向引物 (P1) 2l反向引物 (P2) 2lDNA 模板 1lrTaq酶 0.5l灭菌蒸馏水 35.5l 所有试剂按量仔细添加后，轻轻混匀，稍离心后即可，为了防止反应混合液蒸发，可添加20l矿物油覆盖。,2、PCR仪的参数设置94 2 min94 30sec35 cycles 62 30sec72 30sec72 5 min 3、琼脂糖凝胶电泳检测反应结束后，取5l PCR产品，加入1l 6或10 x loading buffer，混匀后点样，电泳15min。其余45l PCR产品保存在-20冰箱中，下次实验使用。,