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2018/9/21,1,蔗糖酶的分离提纯及酶促 反应动力学实验,(综合性大实验)课件制作、讲授及实验指导:郭慧云,2018/9/21,2,内容提示,本实验含如下内容(1、2、3是酶分离提纯及比活力测定部分的内容;4、5是酶促反应动力学部分的内容): 1、 3,5-二硝基水杨酸比色定糖法(DNS法)工作曲线的制作及三种蔗糖酶样品(E1、E2 、E3)的测定(酶活力); 2、 Folin-酚法测定蛋白质含量工作曲线的制作及三种蔗糖酶样品(E1、E2 、E3)的测定(蛋白质含量); 3、蔗糖酶的分离提纯(细胞破壁、抽提、有机溶剂分级、透析和离子交换柱层析装柱、上样、洗柱、洗脱、收集酶活力峰、保存); 4、蔗糖酶米氏常数的测定(用双倒数法); 5、用正交法测定几种因素对蔗糖酶活力的影响(含实验设计及数据处理的相关知识)。,2018/9/21,3,一、目的要求,1.熟悉工作曲线的制作方法及使用注意事项; 2.学习掌握3,5-二硝基水杨酸比色定糖的原理和方法; 3.学习掌握Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法; 4.学习酶蛋白分离提纯的原理; 5.学习掌握细胞破壁、抽提、有机溶剂分级、透析和离子交换柱层析技术; 6.学习掌握酶的比活力测定及其计算方法; 7.学习掌握酶促反应动力学中用双倒数法测定Km的方法、选择确定酶促反应最适条件(温度、pH值、离子浓度等)的方法; 8.学习正交试验法中最简单的入门知识:用正交表设计试验方案、用极差分析处理试验数据并分析试验结果。,2018/9/21,4,二、实验原理,前 言酶是生物体内具有催化功能的蛋白质,可据酶蛋白的结构和性质选择分离提纯条件和含量测定方法。酶分离提纯的总目标是提高纯度(或比活力)及收率;依据在溶液中的性质(分子大小、溶解度、电荷、吸附等)进行分离; 胞内酶的分离提纯步骤:选材、破壁、提取、分 离、纯化、测活、保存;用测定酶活力的方法跟踪酶的去向、 衡量酶提纯的程度和得率。酶促反应的动力学(反应速度及影响因素): 1)底物浓度对酶促反应速度的影响 2)酶浓度对酶促反应速度的影响 3)pH值对酶促反应速度的影响 4)温度对酶促反应速度的影响 5)激活剂、抑制剂对酶促反应速度的影响.,2018/9/21,5,2018/9/21,6,2018/9/21,7,2018/9/21,8,4、Folin-酚法测定蛋白质含量的原理:1)凡含有两个及两个以上肽键(CONH)的化合物(如双缩脲:H2NCONHCONH2),在碱性溶液中(如Folin-甲试剂)都能与Cu2+作用,形成紫色的复合物;2)蛋白质是由多个氨基酸通过肽键连接起来的,故所有的蛋白质均可与Folin-甲试剂反应,形成紫色的铜-蛋白质复合物;3)铜-蛋白质复合物在pH=10的碱性溶液中可将磷钼酸-磷钨酸(Folin-乙试剂)还原成兰色的钼蓝和钨蓝混合物,其颜色的深浅(在一定范围内)与蛋白质的含量成正比; 在测定液体蛋白质样品含量的常用方法中(双缩脲法、 Folin-酚法和紫外吸收法),Folin-酚法的灵敏度最高(比紫外吸收法高10-20倍,比双缩脲法高100倍),所以我们选用本方法。,2018/9/21,9,5、有机溶剂分级沉淀的原理:有机溶剂分级是利用不同Pr在不同浓度的有机溶剂中溶解度的差异分离酶蛋白的一种方法。其原理是:1)有机溶剂能降低溶液的介电常数,增加Pr分子上不同电荷的引力,使蛋白质的溶解度下降;2)有机溶剂与水作用,能破坏Pr的水化膜,使蛋白质的溶解度下降。 6、离子交换柱层析的原理:是根据物质的酸碱度、极性和分子大小的差异,使其分离的技术。在分离过程中,以离子交换作用为主导;在众多的交换剂中,离子交换纤维素的优点是:,2018/9/21,10,1)有开放性的长链结构、较大的表面积,所以对Pr的吸附容量大; 2)纤维素上离子基团的数量不多且排列疏散,对Pr的吸附不是太牢固,所以用缓和的洗脱条件即可达到分离的目的,不致引起Pr的变性; 3)用其装好的层析柱在较广的pH和盐浓度范围内都不会发生体积的改变,所以有利于Pr的层析。本实验中使用的DEAE-c11是弱碱性的阴离子纤维素,其基本骨架是纤维素、活性基团为二乙基氨乙基。该纤维素的吸附量大,分辨率高,化学性质稳定。,2018/9/21,11,三、实验流程,周三晚上6:00开始 周四下午1:00开始 1、制备蔗糖酶粗品E1 2、制作DNS比色定糖的工作曲线(当天画出工作曲线) 自溶 3、制作Folin-酚法测定蛋白质含量的工作曲线(当天画出工作曲线)抽提(过夜),2018/9/21,12,4、乙醇分级和透析(制E2)离心得E1(无细胞抽提液) 取样、测定酶E1活力及蛋白质浓度 第一次乙醇分级(32%乙醇饱和度) 第二次乙醇分级(47.5%乙醇饱和度) 透析(过夜),2018/9/21,13,5、柱层析的准备工作组装层析装置,装柱、柱平衡(过夜),2018/9/21,14,6、 柱层析(制E3) 周五下1:00开始 离心(得E2 ) 取样、 测酶E2活力及蛋白质浓度 上样 洗柱(用目测酶活力的方法检测目的酶是否挂上) 洗脱 合并酶活力峰,得E3 保存成品E3 测酶E3活力及蛋白质浓度,2018/9/21,15,成品E3 计算出E3浓度周六(全天)上午8:00开始 (1).蔗糖酶米氏常数的测定 (2).用正交法测定几种因素对蔗糖酶 活力的影响,2018/9/21,16,四、操作步骤及注意事项,1、 DNS比色定糖法工作曲线的制作取11支血糖管编号111,按下页表中的顺序和数量加入葡萄糖标准溶液(0.2%)、蒸馏水、3,5-二硝基水杨酸试剂,混匀后同时放入沸水浴中准确反应5分钟(注意:一定等沸水浴锅中的水沸腾后再放入试管,且不要用大玻璃杯代替沸水浴锅;用秒表记时),取出后立即用流动的冷水冷却,加蒸馏水定容至25ml,摇匀,测定540nm处的A值。以葡萄糖(mg)含量为横坐标、A540值为纵坐标,画出工作曲线。,2018/9/21,17,3,5-二硝基水杨酸比色定糖法工作曲线的制作,试号 含糖量 葡萄糖标准液 去离子水 3,5-二硝基水杨酸试剂 A540(mg) (ml) (ml) ( ml)1 0 0 2.0 3 2 0.4 0.2 1.8 33 0.8 0.4 1.6 34 1.2 0.6 1.4 35 1.6 0.8 1.2 36 2.0 1.0 1.0 37 2.4 1.2 0.8 38 2.8 1.4 0.6 39 3.2 1.6 0.4 310 3.6 1.8 0.2 311 4.0 2.0 0 3,2018/9/21,18,2、Folin-酚法测定蛋白质含量工作曲线的制作取7支试管(干燥)按下表中顺序加入各种试剂并进行反应和测定以1号管为参比调零,记录光密度值A650,以标准液的浓度为横坐标, A650值为纵坐标,画出工作曲线。,2018/9/21,19,* Folin-酚法测定蛋白质含量的方法,1.样品的测定:取两支试管(平行)各加入样品液(稀释成一定浓度的)1ml ,其他操作(反应和比色测定)同工作曲线的制作(前页)2.蛋白质浓度的计算:A650值对应的g数(Pr)10-3 Pr (mg/ml)= 稀释倍数Pr溶液的ml数,2018/9/21,20,*制作工作曲线的注意事项1.分光光度计的使用:1)测样时,光吸收值A应在0.1000.700之间,并小于标准曲线的最大值,否则,缩小or加大样品的稀释倍数,重测!2)其他,见(523室)操作规程; 2.比色杯的使用:1).洗净(洗净的标准是:透明、无痕迹、不挂水珠)后,置小烧杯内用蒸馏水浸没;2).用蒸馏水or buffer校正(方法在仪器室讲),然后在杯底标上记号(0、1、2、3);3).向杯中加样液时,按浓度从低到高的顺序加,注意加样到比色杯的2/3处;4).如样液有外溢,先用滤纸条吸干(不许檫);再用镜头纸向一个方向檫至透明;5).将装有参比、样品溶液的比色杯放入比色杯架上时,要摆放在一条直线上;,2018/9/21,21,6).倒出液体后,一定要用洗瓶中的蒸馏水洗净,然后倒置在滤纸上吸干;7).任何情况下都不许把比色杯放在仪器盖上;8).自备废液杯(盛废液及废纸块用);9).各台分光光度计的比色杯是配套的,不许随意调换使用。 3.工作曲线的制作(以Folin-酚法测定蛋白质含量的工作曲线为例)1)反应:取液量准确:移液管洗净、标号、润洗,最好同一人取样;温度准确:(恒温水浴中放有温度计),记时准确(用秒表);所用的标准液、buffer、反应液应是同一批配制的; 加入Folin-乙试剂时要特别小心!因为Folin-乙试剂只有在酸 性条件下稳定,而反应是在碱性溶液中进行,所以加入Folin-乙试剂后,一定要迅速摇匀(加一管摇一管);,2018/9/21,22,2)测量: 由同一个人读数;制作标准曲线及测量样品使用同一台仪器; 3)记录: 实验记录本记录要清晰(不许用纸片),实验结束后要请教师签字; 记录仪器使用情况。 4)制图: 标明:曲线名称、纵横坐标的单位、仪器号、使用时间;注意实验点的分布、大小(依据误差)、直线的角度(最好在45度左右);不许延长工作曲线(比耳定律适用于稀溶液中的反应)。 附:标准液的配制:浓度必须准确,要注意烘干、称量、定容等操作;分装or取液时防止被稀释!,2018/9/21,23,3、 蔗糖酶粗品(E1)的制备自溶:15g(一小袋)高活性干酵母粉倒入250ml烧杯中、少量多次地加入50ml蒸馏水,搅拌均匀,成糊状后加入1.5g乙酸钠、25ml乙酸乙酯,搅匀,再于35 恒温水浴中搅拌30分钟,观察菌体自溶现象; 抽提:补加蒸馏水30ml,搅匀,盖好,于35 恒温过夜,8000r/min离心10min,弃沉淀及脂层,得E1(无细胞提取液);量体积V1=( )ml(取出2ml置于冷处或冰盐浴中保存,待测酶活力及蛋白质浓度)。 4、乙醇分级和透析(制E2) 测E1pH、用稀HAC调pH至4.5(注意少量、慢加、搅匀,防止调过); 第一次乙醇分级(32%乙醇饱和度):计算出使E1的乙醇浓度达32%时,所需95%乙醇的体积X1,将E1和乙醇X1,放入冰盐浴中预冷,在不断搅拌下,缓慢滴加乙醇,3000r/min,离心5min,弃沉淀,留上清;,2018/9/21,24, 第二次乙醇分级(47.5%乙醇饱和度):同上法加入X2(为达47.5%乙醇饱和度时需要补加的95%乙醇的体积),离心3min,弃上清,沉淀立刻用10ml 0.005mol/L pH6.0的磷酸buffer溶解,并装入透析带(截止分子量一万的),对上述buffer透析过夜;次日,3000r/min离心3min,得E2,量体积V2=( )ml(留出2ml置于冷处或冰盐浴中保存,待测酶活力及蛋白质浓度),其他酶液准备上样。5. 柱层析(制E3) 装柱:本实验使用的层析柱是自加工的,用泡沫海绵为筛板。装入纤维素前,先把柱内装满起始缓冲液,用玻璃棒挤压海绵,赶尽气泡并把柱子垂直固定;将纤维素用起始缓冲液调稀、搅允后加入,柱内的纤维素应非常均匀地分布,防止出现节面和气泡,床面要平整,床高距柱顶23cm为宜;用起始缓冲液洗柱,控制好流速(防止流干),于4平衡过夜。,
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