史上最复杂串息,自我介绍,万 敏13504314715（单向收费）QQ:1040163877wanmin4715163.com,第四篇 分子医学专题分子医学时代：分子生物学将现代医学带入分子时代,第四篇 分子医学专题分子医学时代：分子生物学将现代医学带入分子时代里程碑式成就： 1956年：镰状细胞贫血病因是一个氨基酸发生了改变 1976年：src癌基因（导致鸡肉瘤Sarcoma）的发现 1978年：对镰状细胞贫血进行了产前基因诊断 1982年：基因重组产品人胰岛素问世 1990年：第一例基因治疗实施,镰状细胞贫血病因是一个氨基酸发生了改变,珠蛋白的第6位谷氨酸变为缬氨酸,第四篇 分子医学专题分子医学时代：分子生物学将现代医学带入分子时代里程碑式成就： 1956年：镰状细胞贫血病因是一个氨基酸发生了改变 1976年：src癌基因（导致鸡肉瘤Sarcoma）的发现 1978年：对镰状细胞贫血进行了产前基因诊断 1982年：基因重组产品人胰岛素问世 1990年：第一例基因治疗实施,第四篇 分子医学专题第二十章 常用分子生物学技术的原理及其应用第一节 分子杂交与印迹技术 第二节 PCR技术的原理与应用 第三节 基因文库 第四节 生物芯片技术 第五节 生物大分子相互作用研究技术,第二十章 常用分子生物学技术的原理及其应用第一节 分子杂交与印迹技术一、分子杂交和印迹技术的原理（一）印迹技术 （二）探针技术,第二十章 常用分子生物学技术的原理及其应用第一节 分子杂交与印迹技术一、分子杂交和印迹技术的原理 （复）分子杂交 （一）印迹技术 （二）探针技术,第二十章 常用分子生物学技术的原理及其应用 第一节 分子杂交与印迹技术 一、分子杂交和印迹技术的原理 （复）分子杂交（提问）,第二十章 常用分子生物学技术的原理及其应用 第一节 分子杂交与印迹技术 一、分子杂交和印迹技术的原理 （复）分子杂交：具有互补序列的两条核酸单链 ，在一定条件下，按碱基互补配对的原则形成双链的过程。,磷酸,碱基,脱氧核糖,脱氧核糖核苷酸的结构示意图：,H2O,3,5-磷酸二酯键,脱氧核糖核苷酸通过3,5-磷酸二酯键连接起来，形成多核苷酸长链。,18.9.22,15,DNA：基本结构 由四种脱氧核糖核苷酸(dNTP) 通过3-5磷酸二酯键连接而成的长链大分子。,脱氧腺嘌呤核苷酸 (dAMP) 脱氧鸟嘌呤核苷酸 (dGMP) 脱氧胞嘧啶核苷酸 (dCMP) 脱氧胸腺嘧啶核苷酸 (dTMP),DNA：双螺旋结构,DNA分子是由两条相互平行的脱氧核糖核苷酸长链盘绕而成,DNA分子中的脱氧核糖和磷酸交替连接排在外侧，构成基本骨架，碱基排列在内侧。,两条链上的碱基通过氢键相结合，形成碱基对（碱基互补配对原则）。,A T,G C,第二十章 常用分子生物学技术的原理及其应用 第一节 分子杂交与印迹技术 一、分子杂交和印迹技术的原理 （复）分子杂交：具有互补序列的两条核酸单链 ，在一定条件下，按碱基互补配对的原则形成双链的过程。,DNA,RNA,RNA DNA,（复）分子杂交：具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基互补配对的原则形成双链的过程。,（复）分子杂交：DNA变性与复性,DNA变性：加热、强碱和有机溶剂作用下 氢键断裂，两条单链分开 磷酸二酯键不受影响，碱基排列顺序保持不变,DNA的复性：去除变性条件 单链DNA在溶液中随机碰撞 互补单链通过碱基配对形成氢键 两条重新缠绕在一起的互补链不一定是原来的两条链,（复）分子杂交：DNA变性与复性,具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下按碱基互补配对的原则形成双链的过程。,第二十章 常用分子生物学技术的原理及其应用 第一节 分子杂交与印迹技术 一、分子杂交和印迹技术的原理（复）分子杂交（一）印迹技术：将样品转移到固相载体上，再利用相应的检测反应来检测样品的一种方法。,Edwin Mellor Southern 埃德温 迈勒 萨瑟恩,1975年，英国人Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA-RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。,（一）印迹技术,第二十章 常用分子生物学技术的原理及其应用 第一节 分子杂交与印迹技术 一、分子杂交和印迹技术的原理 （复）分子杂交 （一）印迹技术:毛细管虹吸法,（一）印迹技术:毛细管虹吸法,第二十章 常用分子生物学技术的原理及其应用 第一节 分子杂交与印迹技术 一、分子杂交和印迹技术的原理（一）印迹技术电转移印迹技术真空吸引转移印迹技术,第二十章 常用分子生物学技术的原理及其应用 第一节 分子杂交与印迹技术 一、分子杂交和印迹技术的原理 （复）分子杂交 （一）印迹技术:转膜技术 （二）探针技术,在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链。其中一条单链由于被标记上可检测的信号而称为探针。,将已知序列的核酸片段 (单链RNA或DNA)进行标记,使之带有特殊可检测信号，作为探针，与未知DNA或RNA单链进行分子杂交,检测未知DNA或RNA单链中，是否存在与探针序列互补的特定序列。,（二）探针技术,Detect Hybrids,denature,Hybridize,2. 加入变性的探针DNA,1. 变性,3. 杂交,4. 检测杂交体,（二）探针技术,1、探针类型 DNA 探针：外显子区 cDNA 探针：特异性高 RNA 探针：特异性高，本底低 寡核苷酸探针：人工合成，检测突变 2、探针标记 同位素标记： 32P， 35S，3H 非同位素标记：生物素、地高辛、荧光素,（二）探针技术,2、探针标记（1）DNA酶I：随机切割DNA单链（2）DNA聚合酶I：1）5 3 外切酶2）5 3聚合酶,2、探针标记,3,5,3,3,5,5,5,DNA Pol I,3XdNTPs+labled-dATP,DNase I,3,3,5,5,5,3,缺口平移法标记探针：,DNaseI 在dsDNA上切割3-5磷酸二酯键。 DNA PolI 延着5-3方向切旧链，然后再合成新链。,ds-DNA template,Mg 2+,Detect Hybrids,denature,Hybridize,2. 加入变性的探针DNA,1. 变性,3. 杂交,4. 检测杂交体,（二）探针技术,第二十章 常用分子生物学技术的原理及其应用 第一节 分子杂交与印迹技术 一、分子杂交和印迹技术的原理 （复）分子杂交：不同单链形成杂交双链 （一）印迹技术：转膜技术 （二）探针技术：标记已知单链,第二十章 常用分子生物学技术的原理及其应用 第一节 分子杂交与印迹技术 一、分子杂交和印迹技术的原理 （复）分子杂交：不同单链形成杂交双链 （一）印迹技术：转膜技术 （二）探针技术：标记已知单链二、印迹技术的类别及应用 （一）DNA印迹 （二）RNA印迹 （三）蛋白质印迹,二、印迹技术的类别及应用 （一）DNA印迹（Southern blotting）,Edwin Mellor Southern,（一）DNA印迹(Southern blotting)将电泳分离的待测基因组DNA酶切片段转移到一定的固相支持物上，然后与标记的核酸探针进行杂交的过程。,基本程序： 1、电泳分离DNA片段 2、DNA的转膜 3、DNA与探针杂交 4、检测杂交信号,将内切酶消化的DNA片段进行电泳.,二、印迹技术的类别及应用 （一）DNA印迹（Southern blotting）,胶中的DNA经变性及中和后, 转膜,二、印迹技术的类别及应用 （一）DNA印迹（Southern blotting）,标记的探针与DNA的杂交,检测杂交信号,二、印迹技术的类别及应用 （一）DNA印迹（Southern blotting）,放射自显影照片,（一）DNA印迹将电泳分离的待测基因组DNA酶切片段转移到一定的固相支持物上，然后与标记的核酸探针进行杂交的过程。,基本程序： 1、电泳分离DNA片段 2、DNA的转膜 3、DNA与探针杂交 4、检测杂交信号,提取基因组DNA,限制性内切酶消化,电泳分离,Southern blot (卫星DNA探针),身份确认,人类DNA指纹图,亲子鉴定 A和C是亲生女儿；B为妻子和其前夫所生；D为养女。,第二十章 常用分子生物学技术的原理及其应用 第一节 分子杂交与印迹技术 一、分子杂交和印迹技术的原理 二、印迹技术的类别及应用（一）DNA印迹:DNA定性和定量分析（二）RNA印迹（三）蛋白质印迹,（二）RNA印迹（Northern blotting）将电泳分离的待测RNA转移到一定的固相支持物上，然后与标记的核酸探针进行杂交的过程。,基本程序： 1、电泳分离RNA 2、RNA的转膜 3、RNA与探针杂交 4、检测杂交信号,其序列与DNA的模板链互补。 是蛋白质生物合成的模板，因此，mRNA的碱基序列决定蛋白质的氨基酸顺序。 mRNA中的三个碱基为一个密码子，负责编码一个氨基酸。,RNA,Northern印迹特点： 1.检测RNA 2.电泳前无需酶切 3.电泳后无需变性,第二十章 常用分子生物学技术的原理及其应用 第一节 分子杂交与印迹技术 一、分子杂交和印迹技术的原理 二、印迹技术的类别及应用（一）DNA印迹:DNA定性和定量分析（二）RNA印迹:RNA定性和定量分析（三）蛋白质印迹,第二十章 常用分子生物学技术的原理及其应用 第一节 分子杂交与印迹技术 一、分子杂交和印迹技术的原理 二、印迹技术的类别及应用 （三）蛋白质印迹：在电场的作用下将电泳分离的蛋白质从凝胶转移至一种固相支持物，然后用这种蛋白质的特异抗体来检测。,（三）蛋白质印迹：在电场的作用下将电泳分离的蛋白质从凝胶转移至一种固相支持物，然后用这种蛋白质的特异抗体来检测。,（三）蛋白质印迹,基本程序： 1、电泳分离蛋白质 2、蛋白质的转膜 3、蛋白与抗体结合 4、检测抗体信号,1、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳： 不连续的电泳缓冲体系。 SDS蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再受蛋白质电荷与形状的影响，而只取决于蛋白质分子量的大小。,（三）蛋白质印迹,（三）蛋白质印迹：2、电转移,（三）蛋白质印迹：3、抗原抗体反应,（三）蛋白质印迹：4、显色反应化学显色法 :同位素法 :化学发光法 : 荧光底物法：,第二十章 常用分子生物学技术的原理及其应用 第一节 分子杂交与印迹技术 一、分子杂交和印迹技术的原理二、印迹技术的类别及应用 （一）DNA印迹:DNA定性和定量分析 （二）RNA印迹:RNA定性和定量分析 （三）蛋白质印迹:蛋白质定性和定量分析 （四）斑点印迹 （五）原位杂交 （六）DNA芯片技术,（四）斑点印迹（Dot Blotting）,将RNA或DNA变性后直接点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，然后加入标记的核酸探针进行杂交。优点：可以在一张膜上进行多个样品的检测。,在保持细胞基本形态的情况下（不从组织或细胞中提取核酸），用探针在细胞的原位检测靶DNA的存在情况, 这种核酸分子杂交技术称原位杂交。,