第六章 蛋白质的结构和功能,主要内容,蛋白质与配体的可逆结合肌红蛋白与血红蛋白 蛋白质与配体结合的空间互补性免疫球蛋白 化学能对蛋白质相互作用的影响肌球蛋白与肌动蛋白,肌红蛋白与血红蛋白,为什么Mb与Hb能结合氧？,铁原子只有亚铁态的蛋白质才能结合氧。Mb或Hb蛋白质提供疏水洞穴，固定血红素基，保护血红素铁免遭氧化，为氧提供一个结合部位。结合氧只发生暂时电子重排。,Mb与Hb结构上的相同与不同之处是什么？,链、链和Mb的三级结构非常相似,只要功能相同（都与氧结合），高级结构就相似，有时甚至是唯一的。,Hb与Mb结构上最大不同在于血红蛋白有四级结构，是四聚体，而肌红蛋白只有三级结构。,血红蛋白运载氧能力增强，还能运载H+和CO2，在氧分压变化不大范围内完成载氧和卸氧工作。且Hb为变构蛋白，可受环境中其他分子，如H+，CO2和2，3-二磷酸甘油酸（BPG）的调节。,协同效应与别构效应,氧与血红蛋白结合是协同进行的，具有正协同性同促效应，即一个氧分子与Hb结合，使同一Hb分子中其余空的氧结合部位对氧亲和力增加，再结合第二、三、四个氧分子则比较容易。,H+，CO2和BPG与Hb结合部位离血红素基甚远，是通过别构效应调节Hb与氧的结合。 pH降低（H+增加），CO2压力增加均降低血红蛋白对氧亲和力，促进血红蛋白释放氧；反之高浓度氧又促使脱氧血红蛋白释放H+和CO2。 （Bohr效应） BPG降低Hb对氧亲和力。,镰刀型贫血病,血液中含大量镰刀形红细胞HbS，没有足够可承担输氧的正常圆形细胞HbA。镰刀状细胞贫血病是血红蛋白分子突变引起的。,氨基酸测序发现HbA与HbS区别在于-链上6-位Glu（HbA）变为Val（HbS），结果由于疏水相互作用，-链上6-Val与1-Val接近，使血红蛋白分子从扁平状压缩变形，形成细长聚集体红细胞，构成镰刀形，与氧结合力降低。,免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）,蛋白质与配体结合的空间互补性免疫球蛋白,1、免疫球蛋白是指具有抗体（antibody）活性，或化学结构与抗体相似的球蛋白。一般情况下，免疫球蛋白指的就是抗体。2、抗体具有两个显著特点：高度的特异性和庞大的多样性。,蛋白质与配体结合的空间互补性免疫球蛋白,一、基本概念,3、抗原(antigen, Ag)是一类能诱导免疫系统发生免疫应答，并能与免疫应答的产物(抗体或效应细胞)发生特异性结合的物质。抗原具有免疫原性和反应原性两种性质。 4、免疫原性是指抗原刺激机体后，机体免疫系统能形成抗体或致敏T淋巴细胞的特异性免疫反应。 5、反应原性是指产生的抗体或致敏T淋巴细胞能与抗原进行特异性结合的免疫反应。,蛋白质与配体结合的空间互补性免疫球蛋白,6、既具免疫原性又具反应原性的抗原称免疫原。某种物质之所以能成为一个良好的免疫原，是因为它有特异的化学结构，这就是抗原决定簇。抗原决定簇可以与相应的淋巴细胞表面的受体蛋白结合引起免疫应答。一个抗原决定簇只能激活一种淋巴细胞(对于B细胞)只刺激产生一种类型抗体。一个抗原可以有一个或多个抗原决定簇。抗原决定簇少，抗体与抗原结合就少，往往就见不到反应。天然抗原或复杂的半抗原决定簇往往多达几十个，因此可以与很多抗体分子交互结合。,蛋白质与配体结合的空间互补性免疫球蛋白,7、有些分子本身没有免疫原性，不能引起免疫反应，但是如果把它们和某些载体分子，如蛋白质分子结合起来就有了免疫原性，就能使动物对这一复合分子产生特异的抗体。这种本身无免疫原性，但有反应原性，一旦把它与载体结合就有了免疫原性的物质，就称半抗原或不完全抗原。,蛋白质与配体结合的空间互补性免疫球蛋白,二、IgG的结构,IgG是呈Y型结构的球蛋白。,蛋白质与配体结合的空间互补性免疫球蛋白,轻链：25KD，214个氨基酸残基 重链：50KD，450-570个氨基酸残基,蛋白质与配体结合的空间互补性免疫球蛋白,根据组成多肽链的大小可分为轻链（Light chain, L）和重链（Heavy chain, H）,可变区VL & VH 恒定区CH1, CH2, CH3 铰链区,根据L链和H链一级结构的序列同源性可分为可变区（Variable domain, V）和恒定区（Constant domain, C）,蛋白质与配体结合的空间互补性免疫球蛋白,可变区又可进一步分为超变区（或称互补决定区）和骨架区。,蛋白质与配体结合的空间互补性免疫球蛋白,三、免疫球蛋白对抗原的识别,抗体的抗原结合部位与抗原决定簇在空间结构上是互补的。多数情况下，这种互补性是在抗原结合部位与抗原决定簇靠近的过程中，通过相互影响对方的结构形成的。,蛋白质与配体结合的空间互补性免疫球蛋白,蛋白质与配体结合的空间互补性免疫球蛋白,抗体的抗原结合部位与抗原决定簇分子表面基团的相互作用，包括静电引力、氢键、范德华力、疏水作用等。 抗原与抗体的结合需要合适的温度、pH、缓冲体系，这种结合是可逆的。,蛋白质与配体结合的空间互补性免疫球蛋白,蛋白质与配体结合的空间互补性免疫球蛋白,磷酸胆碱与其抗体的相互作用力,四、免疫球蛋白的类别,根据免疫球蛋白分子结构的不同可分为5类：IgG、IgM、IgA、IgD、IgE。,蛋白质与配体结合的空间互补性免疫球蛋白,IgG是血清中最丰富的免疫球蛋白。,蛋白质与配体结合的空间互补性免疫球蛋白,五、多克隆抗体与单克隆抗体,多克隆抗体是识别一个抗原的不同部分的多种抗体的混合物。,蛋白质与配体结合的空间互补性免疫球蛋白,单克隆抗体是由生长在细胞培养物中的同一B细胞的群体（一个克隆）合成并分泌的、均一的、识别同一抗原表位的抗体。,六、基于免疫反应的生化分析方法,酶联免疫吸附测定（ELISA）：以待测抗原（或抗体）与酶标抗体（或抗原）的特异结合反应为基础，通过酶活力测定来确定抗原（或抗体）含量。 因为结合了免疫反应和酶催化反应，所以是一种特异而又敏感的技术。,蛋白质与配体结合的空间互补性免疫球蛋白,酶标仪和酶标板,蛋白质与配体结合的空间互补性免疫球蛋白,基本原理,先将已知的抗体或抗原结合在某种固相裁体上，并保持其免疫活性。测定时，将待检标本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应。用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离成分。然后加入酶的作用底物催化显色，进行定性或定量测定。 根据检测目的和操作步骤不同，有间接法、双抗体夹心法、竞争法三种类型的常用方法。,蛋白质与配体结合的空间互补性免疫球蛋白,ELISA的基本类型,间接法。此法是测定抗体最常用的方法。将已知抗原吸附于固相载体，加入待检标本(含相应抗体)与之结合。洗涤后，加入酶标抗球蛋白抗体(酶标抗抗体)和底物进行测定。,蛋白质与配体结合的空间互补性免疫球蛋白,ELISA的基本类型,双抗体夹心法。此法常用于测定抗原, 将已知抗体吸附于固相载体, 加入待检标本(含相应抗原)与之结合。温育后洗涤，加入酶标抗体和底物进行测定。,蛋白质与配体结合的空间互补性免疫球蛋白,ELISA的基本类型,竞争法。此法可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体。以测定抗原为例, 将特异性抗体吸附于固相载体；加入待测抗原和一定量的酶标已知抗原，使二者竞争与固相抗体结合；经过洗涤分离，最后结合于固相的酶标抗原与待测抗原含量呈负相关。,蛋白质与配体结合的空间互补性免疫球蛋白,免疫印迹测定（Western blotting）是一种借助特异性抗体鉴定抗原的有效方法。将含有目标蛋白(抗原)的样品首先用电泳分离后，通过转移电泳转印至硝酸纤维素膜或其它膜的表面，然后将膜表面的蛋白质再用抗原抗体反应进行特异性检测。,蛋白质与配体结合的空间互补性免疫球蛋白,Western blotting,蛋白质与配体结合的空间互补性免疫球蛋白,免疫亲和层析（Immunoaffinity chromatography）是利用抗原和抗体所具有的专一亲和力而设计的层析技术。抗原和抗体在一定条件下能紧密结合成复合物，而这种结合又是可逆的，改变条件可将抗原抗体解离。当把抗原和抗体的一方(称配体)结合在惰性载体上使其固相化，另一方随流动相流经该载体，双方即结合为一整体。然后设法将它们解离，从而得到与配体有特异结合能力的某一特定的物质。,蛋白质与配体结合的空间互补性免疫球蛋白,蛋白质与配体结合的空间互补性免疫球蛋白,肌球蛋白与肌动蛋白,化学能对蛋白质相互作用的影响肌球蛋白与肌动蛋白,肌纤维的结构,肌肉组织由特殊分化的肌细胞所组成。肌细胞通常也称肌纤维。骨骼肌由骨骼肌纤维组成。骨骼肌纤维呈长圆柱状，其表面有肌膜，是多核细胞，核卵圆形，位于肌纤维之边缘，染色质较丰富，沿核膜分布，有l2个核仁。细胞质称肌浆，内有丰富的肌原纤维。肌浆的基质含有肌红蛋白。肌原纤维是肌纤维中最主要的组分，呈细丝状，沿细胞的长轴平行排列，每条肌原纤维有明暗相间的横纹，而且明暗横纹皆整齐地排列在同一水平，所以整个肌纤维显示出明暗相间的带。用铁苏木精法染色，暗带着色很深，明带着色较浅。,肌原纤维由粗丝和细丝构成,肌原纤维的单位是肌节，藉Z膜隔开，其中央有A带，两侧有I带。I带由I肌丝（主要是肌动蛋白），A带由A肌丝（主要是肌球蛋白）和I肌丝的前一部分组成。,粗肌丝是由许多肌球蛋白分子通过尾部缔合组成的分子束。M线两侧的肌球蛋白对称排列，杆部均朝向粗肌丝的中段，头部则朝向粗肌丝的两端的两端并露出表面。,细肌丝由三种蛋白质分子组成，即肌动蛋白、原肌球蛋白和肌原蛋白。后二种属于调节蛋白，在肌收缩中起调节作用。肌动蛋白（actin）分子单体为球形，许多单体相互接连成串珠状的纤维形，肌动蛋白就是由两条纤维形肌动蛋白缠绕形成的双股螺旋链。每个球形肌动蛋白单体上都有一个可以与肌球蛋白头部相结合的位点。,原肌球蛋白（tropomyosin）是由较短的双股螺旋多肽链组成，首尾相连，嵌于肌动蛋白双股螺旋链的浅沟内。肌原蛋白（troponin）由3个球形亚单位组成，分别简称为TnT、 TnI和 Tnc 。肌原蛋白借TnT而附于原肌球蛋白分子上， TnI是抑制肌动蛋白和肌球蛋白相互作用的亚单位， Tnc 则是能与Ca2相结合的亚单位。,骨骼肌的主要蛋白是肌球蛋白和肌动蛋白,肌球蛋白分子形状如豆芽状，由2条重链（220K）和4条轻链（20k）构成。两条重链的大部分相互螺旋形地缠绕为杆状，构成豆芽状的杆；重链的剩余部分与轻链一起，构成豆芽的瓣。重链氨基端包括ATP的水解位点。,化学能对蛋白质相互作用的影响肌球蛋白与肌动蛋白,肌动蛋白(actin)分子量为43kD，外观呈哑铃状，其确切分子结构尚不清楚。肌动蛋白存在于所有真核细胞中，肌动蛋白在真核细胞进化过程中相当保守，在哺乳动物和鸟类细胞中至少已分离到6种肌动蛋白，4种称为-肌动蛋白，分别为横纹肌、心肌、血管平滑肌和肠道平滑肌所特有，另两种为-肌动蛋白和-肌动蛋白，见于所有肌肉细胞和非肌肉细胞胞质中。不同类型肌肉细胞的-肌动蛋白分子一级结构(约400个氨基酸残基)仅相差46个氨基酸残基，-肌动蛋白或-肌动蛋白与-横纹肌肌动蛋白相差约25个氨基酸残基。,肌丝滑动模型,电镜下观察肌肉收缩时肌原纤维的变化，发现A带长度不变，只是带随收缩程度不同而有变化，由此推论粗肌丝的长度是不变的。 又知道，从一个肌节的H带未端到下一个肌节的H带起端，这一距离等于细肌丝总长度，当肌肉作最大收缩时，H带消失，而这一距离总长度未变，故认为细肌丝的长度也未发生变化。 据上述现象，1959年，赫胥黎和汉森（Huxley Hanson）提出了肌肉收缩的滑动学说“滑动丝模型”，认为在肌肉收缩时肌纤维长度的改变是由于两类肌丝相互滑动之结果。,肌肉收缩的分子机制,肌细胞上的动作电位引起肌质网Ca2+通道开启，肌浆中Ca2+浓度升高，肌钙蛋白与Ca2+结合，引发原肌球蛋白构象改变，暴露出肌动蛋白与肌球蛋白的结合位点。肌动蛋白通过结合与水解ATP、不断发生周期性的构象改变、引起粗肌丝和细肌丝的相对滑动。,