麻风耐药研究进展,中国医学科学院皮肤病研究所 沈建平,麻风耐药的种类,原发性耐药：患者感染了耐药菌后发病继发性耐药：患者治疗后出现对药物耐受。 单疗、剂量、疗程或药代动力学等原因导致耐药。,麻风菌产生耐药的机制,新发麻风患者体内的麻风菌群是由大量药物敏感菌株的优势菌群和少量由于基因自然突变产生的能绕过药物作用部位的药物耐受菌株的弱势菌群组成。患者无论是行单疗，或者尽管有多种药物治疗，但是治疗不规则，均可导致类似于只有单一药物达到有效血浓度的情况，该药物将杀灭对该药物敏感的菌群，而少量因自然突变产生的对该药物耐药的菌株成活，并逐渐大量繁殖成为优势菌群，最终出现对该药耐药表现。,麻风菌产生耐药的机制,尽管有麻风联合化疗，专家担心利福平每月用药监服，而氨苯砜、氯法齐明则为每日自服，病人依从性较差可致后二者药物剂量不足，则类似于利福平单疗。此外氨苯砜与利福平联用时若病人对氨苯砜已耐药则可能亦等同于利福平单疗，最终导致利福平耐药。,麻风菌产生耐药的机制,菲律宾在耐药监测中发现6例未治疗的新发病人存在folp1突变（氨苯砜耐药）株，5例居住于同一乡村（研究暂未发表），提示联合化疗前存在的氨苯砜耐药菌株可能流行传代到现在。这就解释了为何联合化疗后仍然有氨苯砜耐药菌株,麻风菌产生耐药的机制,细菌耐药的产生可以存在多种机制，包括：1、酶性灭活或抑制，（二氢叶酸合成酶， RNA聚合酶， DNA旋转酶）2、修饰抗生素3、减少抗生素与细胞表面靶点的结合，4、关闭细胞表面通道从而降低细胞对抗生素的摄取，主动泵出抗生素分子5、抗生素靶点的过度生成,麻风菌产生耐药的机制,氨苯砜为p-氨基苯甲酸的竞争性抑制物，可竞争性结合并抑制folP基因编码的二氢叶酸合成酶，该酶是细菌叶酸生物合成途径的关键酶，因此是氨苯砜的抗菌作用靶点。目前发现的氨苯砜耐药基因的突变皆发生在folp1片段的砜类耐药决定区域，且90%多发生在编码子53及55区域。 鼠足垫药敏实验提示氨苯砜过敏可按用量分为轻、中、重三种，而耐药基因突变检测法与MFP法比较后发现，存在folP基因突变基本为中重度的氨苯砜耐药,麻风菌产生耐药的机制,利福平为与RNA聚合酶结合，结合抑制DNA依赖的mRNA转录过程，从而发挥其杀菌作用，而rpoB即编码RNAP的亚基的片段。目前发现的与利福平耐药相关的rpoB突变位点主要有密码子425位、531位、407位、408、410位、416位、420位、427位、428位、513位、516位、517位、526位、532位、533位、547位等，其中部分位点的突变仍需要大量标本检测的进一步证实。除点突变致氨基酸置换导致蛋白结构的改变外，尚发现耐药病人rpoB 409位的插入突变，为一个6bp的片段。,麻风菌产生耐药的机制,目前研究发现与氧氟沙星耐药相关的麻风菌突变大多位于基因gyrA片段。 基因gyr编码DNA旋转酶，其中gyrA编码A亚基，gyrB编码B亚基，氧氟沙星等氟喹诺酮类药物可结合DNA旋转酶的A亚基从而抑制DNA的复制。 ：基因gyrA片段上密码子突变部位在89位、91位，92、95位，突变在结核菌的研究中已显示可能与耐药有关。国际上Kim及You等人两项研究各发现一例氧氟沙星耐药病例，为gyrB片段的205位密码子AspAsn突变。,麻风疑似耐药的临床表现,1、细菌指数不阴转或反而升高； 2、近期复发（停药1年内复发）或反复复发多次； 3、化疗后仍然见到完整染色菌； 4、皮损长期存在，消退不明显； 5、治疗中或疗后发生麻风降级反应，皮损增多，扩散。,麻风菌耐药的检测方法,小鼠足垫接种法（MFP）该方法缺点包括耗时太长（一般需6-12月）、标本获取后至接种时间不可太长（一般小于72小时）、需要一定量的活菌方可生长（一般至少5104/ml）等。因此限制了其大范围的应用，但是MFP仍是最经典的麻风药敏检测方法，通常在新方法的研究中作为方法对照。,麻风菌耐药的检测方法,放射性呼吸测定该方法的原理是活的麻风杆菌能氧化14C标记的棕榈酸释放14C标记的CO2，因此可检测出麻风菌的活力及在不同药物作用下活力的改变，从而在2周内检测出药敏结果，然而该方法需要菌量较多，且需要精密的仪器设备，亦限制了其应用。,麻风菌耐药的检测方法,分子生物学方法由于发现了耐药与某些基因的突变有相关性，因此可用分子生物学检测基因突变方式来检测耐药。而分子生物学检测方法较其它方法更为简便省时，对样本运输亦无特殊要求，因此该类方法逐渐发展起来。 将PCR扩增阳性的产物进行测序，直接检测扩增片段的所有核苷酸序列，将其与野生敏感菌株该片段比对后则可寻找突变的有无以及突变位置。,全球麻风菌耐药的形势,MDT针对不同的治疗靶点，以确保至少有一种药物对病人体内的麻风菌可起到杀伤作用。然而，由于种种原因，发现MDT治疗结束后仍有部分病人BI值持续不降或下降缓慢甚至上升，提示治疗不敏感/抵抗的存在，且可能与耐药有关。WHO全球控制项目的数据显示2004-2009年全球的复发病例数维持在2000-3000例/年之间，而报告复发病例的国家数由2004-2008年的40余个激增至2009年的122个后，2010年初病例数为3120例， 提示在各国对复发病例的逐渐重视下，发现的复发病例数亦有上升的趋势。,全球麻风菌耐药的形势,中国近10年来的复发病例数维持在约150例/年，尽管目前发现复发的主要原因为持久菌的繁殖和/或再感染，但是国内存在以下几种可能的导致耐药的危险。中国氨苯砜买不到，但是利福平到处都有买，导致潜在的患者自行利福平单疗。上个世纪产生的氨苯砜耐药菌株的流行传代，在一些患者中可导致潜在的利福平单疗。联合化疗的不规则，导致利福平外的药物血浓度降低，导致实际上的利福平单疗。,全球麻风菌耐药的形势,由于结核杆菌的耐药形势，麻风耐药亦引起国内外学者的重视。2006年的WHO麻风全球规划在印度阿格拉召开的会议上，首次回顾了麻风耐药的问题及目前在耐药检测手段。2008年之前仅三个国家收集MB复发及耐药监测数据，包括哥伦比亚（2006-2008）、印度尼西亚（2000-2005）及缅甸（2005-2007），发现的MB复发病例分别为28、21、20例，其中缅甸仅10例进行了耐药检测。,全球麻风菌耐药的形势,2008年10月WHO在越南河内举行了第一次全球麻风耐药监测会议，参加国家为巴西、埃塞俄比亚、印度、马里、缅甸、越南六个国家，会议报告在监测点共69例复发，其中检测58例。会议提出要扩大耐药监测点和参比实验室数量，改进监测的质量指南。2009年10月WHO在法国巴黎举行的第二次全球麻风耐药监测会议，中国第一次参加监测会，会上还有巴西、哥伦比亚、印尼、巴基斯坦、菲律宾、乌干达、印度、缅甸、越南共报告887例复发病人，其中213例完成耐药检测。,全球麻风菌耐药的形势,2010年11月WHO在日本东京举行第三次全球麻风耐药监测会议增加一个监测点为也门，109例MB复发病人中有88例完成耐药检测。2011年WHO在印度海德拉巴举行第四次全球麻风耐药监测会议。会议认为MDT方案仍然有效，目前监测网络（含实验室）数量要扩大。启动新抗麻风药物研究。鼓励发表与复发有关的临床和其他科研文章，鼓励在新患者中寻找原发性耐药，但是与复发病人的资料要分开。,氨苯砜耐药菌株流行情况,2000-2008年期间三个国家的MB复发病人的耐药检测结果示，有8例氨苯砜耐药突变。2009年的各国耐药监测显示有12例氨苯砜耐药突变。2010年有9例氨苯砜耐药突变，一例位于中国。我国另有2例治疗抵抗病人发现有氨苯砜耐药突变（研究暂未发表）。翁小满等于7例复发病例中发现2例为氨苯砜耐药菌株， 35例新发病人中并未发现氨苯砜耐药。温艳等于35例复发病例中发现12例氨苯砜耐药菌株，用巢式PCR-联合DNA测序，检测31例复发或疑似复发病人的41份石蜡标本，发现8份存在氨苯砜耐药菌株。因此氨苯砜耐药仍主要发生于复发的麻风病人，,氨苯砜耐药菌株流行情况,2011年菲律宾的耐药监测发现6例未治疗的新发病人存在folp1突变株，5例居住于同一乡村（研究暂未发表），提示氨苯砜耐药菌株可能在人群中传播。中国未见到新发病人中有原发性氨苯砜耐药。,利福平耐药菌株流行情况,2000-2008年期间三个国家的MB复发病人中有6例利福平耐药突变。2009年的各国耐药监测显示有9例利福平耐药突变，而中国57例复发病人中仅10例做了利福平耐药突变检测，并未发现阳性病例。2010年8个国家中仅哥伦比亚发现1例利福平耐药突变，我国有1例复发病人发现有利福平耐药突变（研究暂未发表）。 翁小满、温艳等人的两次研究示复发及新发病人中均未发现利福平耐药株。王红斌等用巢式PCR-测序法检测麻风患者的皮损标本，23例患者（其中7例复发）未发现利福平耐药相关的rpoB基因突变。利福平耐药相关的基因突变在中国可能尚少见，仍需大量的样本检测来寻找并验证。,氧氟沙星耐药菌株流行情况,2000-2008年期间三个国家的MB复发病人中未发现有耐药突变。2009年的各国耐药监测显示2例氧氟沙星耐药突变，均位于印度，中国尚未发现氧氟沙星耐药株。2010年数据显示9个国家亦未发现耐药突变菌株。Kim、You等两项在韩国进行的研究各发现一例氧氟沙星耐药株。,麻风耐药研究进展,近期结核菌研究发现克拉霉素耐药可能与23SrRNA的错义突变有关，但Kim、You等两项在韩国进行的研究暂未发现23SrRNA突变的麻风杆菌。其它药物如氯法齐明尚未发现耐药突变位点、米诺环素尚未在麻风中确定耐药株，,摘要,麻风菌耐药研究主要集中于寻找耐药突变位点，其中氨苯砜、利福平、氧氟沙星等耐药已被证实与folP1、rpoB、gyrA三个基因中的不同位点的错义突变相关，克拉霉素、氯法齐明在麻风中尚未发现耐药突变位点，米诺环素尚未确定耐药株。耐药检测方法包括：小鼠足垫接种法、放射性呼吸测定及分子生物学方法,分子生物学目前WHO全球耐药监测主要集中于MB复发病例。在中国，已发现氨苯砜、利福平耐药相关的folP1、rpoB、gyrA突变菌分别为25例和1例。,展望,尽管近年来国内外研究显示耐药病例数的数量及所占比例仍较小，而国内则仅发现氨苯砜耐药麻风菌株，但国内耐药情况是否因监测制度不完善或检测手段不敏感等问题呈现低估状态尚不明确，且国外已有多项研究显示多重耐药菌存在。借鉴于结核杆菌的耐药形势对疾病防控的巨大影响，麻风耐药问题也需引起中国麻风工作者的重视。随着分子生物学技术的进步，将为监测和控制麻风耐药菌株的流行、指导临床用药等提供帮助。,关于在我国加强麻风耐药监测的呼吁,一旦出现广泛福平耐药菌株流行，由于麻风化疗的特点，将导致麻风控制的成果前功尽弃，并将耗费更大的成本开展防治。1、对于联合化疗的复发的患者，复发时皮损细菌密度在2+ 以上；2、细菌长期不阴转；3、治疗中或监测中，患者查菌仍然见到完整染色菌；取皮损活检，长在70-75%的乙醇中，寄国家中心进行耐药检测。,关于在我国加强麻风耐药监测的呼吁,耐药监测标本寄： 210042 江苏省南京市蒋王庙街12号，中国医学科学院皮肤病研究所 孙培文或沈建平收 电话：025-85478031， 手机：13813832053 信箱：shenjpncstdlc.org 每个标本收集费用500元,