资源预览内容
第1页 / 共87页
第2页 / 共87页
第3页 / 共87页
第4页 / 共87页
第5页 / 共87页
第6页 / 共87页
第7页 / 共87页
第8页 / 共87页
第9页 / 共87页
第10页 / 共87页
亲,该文档总共87页,到这儿已超出免费预览范围,如果喜欢就下载吧!
资源描述
蛋 白 质 组 学 是 蛋 白 质蛋 白 质 组 学 是 蛋 白 质 ( protein ) 和 基 因 组和 基 因 组 (genome)研究在形式和内容两方面的结合研究在形式和内容两方面的结合,该该 技术致力于研究某一物种技术致力于研究某一物种、个体个体、器官器官、组织或细组织或细 胞在特定条件胞在特定条件、特定时间所表达的全部蛋白质图谱特定时间所表达的全部蛋白质图谱。蛋白质组学技术蛋白质组学技术蛋白质组与基因组既相互对应又有显著不同蛋白质组与基因组既相互对应又有显著不同,基因基因 组是确定的组是确定的,每个个体只有一个基因组每个个体只有一个基因组,而基因的而基因的 表达调控水平表达调控水平(蛋白组蛋白组)却会发生显著的变化却会发生显著的变化。19941994年年,澳大利亚科学家首澳大利亚科学家首 次提出次提出“蛋白质蛋白质 组组”(PROTEOME)(PROTEOME)这一概念这一概念。蛋白质组的定义:一种细胞蛋白质组的定义:一种细胞 或一个组织的基因表达的全或一个组织的基因表达的全 部蛋白部蛋白。PROTEinsPROTEins expressedexpressed byby a a genOMEgenOME oror tissuetissue对蛋白质组进行研究对蛋白质组进行研究,就是就是 要从整体水平上研究细胞及要从整体水平上研究细胞及 组织内蛋白质的组成及活动组织内蛋白质的组成及活动 规律规律。蛋白质组学(蛋白质组学(Proteomics, 1997Proteomics, 1997)Keith L. Williams, PhDChiefExecutiveChairmanandExecutive DirectorofProteomeSystems,wasthe founderandDirectorofTheAustralian Proteome Analysis Facility (APAF),Marc R. Wilkins, PhDExecutive Vice President and Head of Bioinformatics蛋白质组学类型蛋白质组学类型蛋白质表达谱蛋白质表达谱全谱全谱蛋白质差异表达谱蛋白质差异表达谱差异谱差异谱蛋白质翻译后修饰蛋白质翻译后修饰修饰谱修饰谱蛋白质相互作用蛋白质相互作用功能谱功能谱蛋白质结构蛋白质结构结构谱结构谱双向电泳技术双向电泳技术 TwoDimensional Electrophoresis,2-D 等电聚焦等电聚焦 平衡平衡 SDS-PAGE电泳电泳 技术成熟,容量、灵敏度、分辨率都较佳,应用广技术成熟,容量、灵敏度、分辨率都较佳,应用广平衡平衡SDS、尿素、尿素 1、DTT 2、碘乙酰胺、碘乙酰胺技术最成熟技术最成熟容量大容量大灵敏度高灵敏度高分辨率高分辨率高可同时获得等电点可同时获得等电点 和分子量和分子量定量效果较好定量效果较好重复性较好重复性较好可比较差异可比较差异直观直观设备便宜设备便宜蛋白质有偏好性蛋白质有偏好性胶内蛋白质后处理复杂胶内蛋白质后处理复杂总灵敏度不高总灵敏度不高动态范围不宽动态范围不宽劳动强大劳动强大双向电泳技术的优点和缺点双向电泳技术的优点和缺点注意问题注意问题 制样制样1)尽量少的处理步骤,以免影响重复性,并减少可能的污染)尽量少的处理步骤,以免影响重复性,并减少可能的污染2)细胞、组织、动植物等不同来源的样品应有不同的处理方)细胞、组织、动植物等不同来源的样品应有不同的处理方式(细胞裂解、式(细胞裂解、TCA/丙酮沉淀)丙酮沉淀) 重复性重复性IPG胶的批次重复性、胶的批次重复性、一向到二向的转移、二向胶的配制、染一向到二向的转移、二向胶的配制、染色条件控制色条件控制 角蛋白污染角蛋白污染全程戴手套操作,尽量避免样品在空气中暴露全程戴手套操作,尽量避免样品在空气中暴露2D-E map of protein from Arabidopsis seeds 30 h after germinationQuantitative analysis of cp29A and cp29B from seeds at 0-96 h after germination 双向电泳的关键指标双向电泳的关键指标重复性重复性样本来源;批量同步处理、运行及实验操作样本来源;批量同步处理、运行及实验操作分辩率分辩率容量和展示的斑点数;染色方法,电泳条件容量和展示的斑点数;染色方法,电泳条件如何提高双向电泳分辨率如何提高双向电泳分辨率样品分步提取和预分级样品分步提取和预分级加长一向胶的长度加长一向胶的长度7、11、13、18、24 cm窄区带窄区带pH梯度梯度IPGpH3-10, pH4-7, pH6-11, pH5-6.新型电泳体系新型电泳体系荧光差异显示双向电泳技术荧光差异显示双向电泳技术早期的蛋白质组学研究内容主要是蛋白质组的表早期的蛋白质组学研究内容主要是蛋白质组的表 达模式,即利用常规达模式,即利用常规2-DE技术鉴定并建立某一生物体技术鉴定并建立某一生物体 在特定时期的全部蛋白表达谱。在特定时期的全部蛋白表达谱。然而,然而, 蛋白质组在不同生命进程中是蛋白质组在不同生命进程中是动态变化动态变化 的,不同生物的个体、组织或细胞在不同发育时期,的,不同生物的个体、组织或细胞在不同发育时期, 分化阶段,以及不同的生理,病理条件下基因表达是分化阶段,以及不同的生理,病理条件下基因表达是 不一致的,所对应的蛋白质组具有特异性。不一致的,所对应的蛋白质组具有特异性。比较蛋白质组学比较蛋白质组学(comparative proteomics) 应运而生,成为后基因组学时代重要学科。应运而生,成为后基因组学时代重要学科。2 2- -D DIGED DIGE技术原理技术原理2D2D- -DIGE DIGE 双向荧光差异凝胶电泳双向荧光差异凝胶电泳极大地提高了结果的极大地提高了结果的准确性准确性(25 pg)、可靠性和重复可靠性和重复 性性。DIGE技术可检测到样品间小于技术可检测到样品间小于10%的蛋白表达差异的蛋白表达差异, 统计学可信度达到统计学可信度达到95%以上以上。缺点:缺点:1. 标记过程中的共价修饰和荧光探针淬灭作用可能改变标记过程中的共价修饰和荧光探针淬灭作用可能改变 样品中蛋白的某些性质样品中蛋白的某些性质。2. 标记蛋白间的轻微相对分子质量的差异标记蛋白间的轻微相对分子质量的差异,会导致分离会导致分离 后蛋白质的后续分析出现偏差后蛋白质的后续分析出现偏差。3. 需特别的扫描仪和荧光染料需特别的扫描仪和荧光染料,染色成本较高染色成本较高。蛋白质质谱分析技术蛋白质质谱分析技术现行质谱仪主要有三个连续的组成部分现行质谱仪主要有三个连续的组成部分,即即离子源离子源,离子分离区离子分离区和和检测器检测器。较常用的有基质辅助的激光解析电离较常用的有基质辅助的激光解析电离-飞行时间质谱飞行时间质谱(Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight spectrometry,MALDI-TOF)和)和电喷雾质谱(电喷雾质谱(Electrospray ionization,ESI-MS)。)。将蛋白质酶解成小肽段后与基质将蛋白质酶解成小肽段后与基质(主要是有机酸主要是有机酸)混合混合,将样将样 品混合物点到金属靶表面上并使之干燥结晶品混合物点到金属靶表面上并使之干燥结晶,然后用激光轰击然后用激光轰击, 将呈离子化气体状态的待分析物从靶表面喷射出去将呈离子化气体状态的待分析物从靶表面喷射出去。离子化气离子化气 体肽段在电场中被加速后到达检测器的时间由肽段的质量和其体肽段在电场中被加速后到达检测器的时间由肽段的质量和其 所带电荷数的比值所带电荷数的比值(m/z)决定决定。MALDIMALDI- -TOFTOF的工作原理的工作原理将感兴趣的蛋白点回收后,进行将感兴趣的蛋白点回收后,进行胰蛋白酶胶内酶解胰蛋白酶胶内酶解, 收集酶解肽段。收集酶解肽段。一级质谱一级质谱将经蛋白酶降解后的肽段按照质荷比(将经蛋白酶降解后的肽段按照质荷比(m/z) 及强度(及强度(intensity)进行解析,形成)进行解析,形成肽指纹图谱肽指纹图谱 (PMF),),每个母离子峰代表一种肽段,其强度代每个母离子峰代表一种肽段,其强度代 表了肽段多少。表了肽段多少。二级质谱二级质谱是挑选一级质谱中有代表性的母离子峰以诱是挑选一级质谱中有代表性的母离子峰以诱 导碰撞解离(导碰撞解离(collision-induced dissociation,CID) 方式打碎,形成方式打碎,形成肽段碎片指纹图谱(肽段碎片指纹图谱(PFF)。然后,。然后, 结合一级结合一级PMF和二级和二级PFF数据,进行数据库搜索,获数据,进行数据库搜索,获 得蛋白质的具体鉴定信息。得蛋白质的具体鉴定信息。双向凝胶点切割双向凝胶点切割蛋白质数据库蛋白质数据库蛋白质鉴定蛋白质鉴定胶内酶切、提取肽混合物胶内酶切、提取肽混合物 (Trypsin, Lys-C)肽质量指纹肽质量指纹 谱谱(PMF)串联质谱串联质谱 序列测定序列测定胶内蛋白鉴定技术胶内蛋白鉴定技术二(多)维色谱质谱技术二(多)维色谱质谱技术 (2DLC2DLCMS/MSMS/MS,MDLCMDLC- -MS/MSMS/MS)高通量;高通量; 可全自动化;可全自动化; 灵敏度较高;灵敏度较高; 基本无蛋白质偏好性;基本无蛋白质偏好性; 适合功能蛋白质组学;适合功能蛋白质组学; 做比较蛋白质组学较难;做比较蛋白质组学较难; 难以获得等电点;难以获得等电点; 仪器成本较高;仪器成本较高; 存在假阳性存在假阳性1.磷酸化磷酸化 TiO2、IMAC 富集,特异性抗体富集,特异性抗体2. 泛素化泛素化 样品富集有一定难度样品富集有一定难度3. 甲基化、乙酰化甲基化、乙酰化特异性抗体特异性抗体4. 糖基化糖基化 单个糖蛋白的单个糖蛋白的N糖基化修饰的位点分析糖基化修饰的位点分析蛋白质翻译后修饰位点分析蛋白质翻译后修饰位点分析蛋白质复合体及翻译后修饰分析策略蛋白质复合体及翻译后修饰分析策略(1). (1). 基因组的诠释基因组的诠释(2). (2). 蛋白质表达与信号通路的研究蛋白质表达与信号通路的研究(3). (3). 蛋白质翻译后修饰与基因调控蛋白质翻译后修饰与基因调控(4). (4). 蛋白质结构、功能、蛋白质结构、功能、定位定位及病理机制研究及病理机制研究(5). (5). 蛋白质蛋白质- -蛋白质相互作用与药物设计蛋白质相互作用与药物设计(6). (6). 候选生物标志物发现与新药研发候选生物标志物发现与新药研发(7).(7). 临床早期诊断和治疗及愈后评价临床早期诊断和治疗及愈后评价(8). (8). 疾病蛋白质组学与生物芯片疾病蛋白质组学与生物芯片蛋白质组学热点研究蛋白质组学热点研究 凝胶阻滞实验凝胶阻滞实验 酵母单杂交技术酵母单杂交技术 染色质免疫沉淀技术染色质免疫沉淀技术 噬菌体展示技术噬菌体展示技术 DNaseI足迹实验足迹实验 甲基化干扰实验甲基化干扰实验 体内足迹实验体内足迹实验 核酸适体技术核酸适体技术 蛋白质芯片技术及纳米技术蛋白质芯片技术及纳米技术蛋白质及核酸相互作用技术蛋白质及核酸相互作用技术凝胶阻滞实验凝胶阻滞实验 (Electrophoretic mobility shift assayElectrophoretic mobility shift assay,EMSAEMSA)凝胶阻滞实验(凝胶阻滞实验(gel retardation assay),又叫作),又叫作DNA迁移率迁移率 变动试验(变动试验
网站客服QQ:2055934822
金锄头文库版权所有
经营许可证:蜀ICP备13022795号 | 川公网安备 51140202000112号